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       【摘要】 
       目的优化草乌中乌头类生物碱提取方法，比较草乌、附子生品及市售炮制品中乌头类生物碱的含量，为相关中药中生物碱的测定和临床应用提供参考。方法分别用7种提取方法提取附子中乌头类生物碱，比较各方法对3种双酯型生物碱的提取效率，并测定乌头类生药及其炮制品中乌头类生物碱含量。结果10%氨水乙醚冷浸法对3种双酯型生物碱的提取效率最高。炮制品中的乌头类生物碱含量明显低于生药，各种炮制品中乌头类生物碱的含量差别也比较大。结论采用10%氨水乙醚冷浸法，高效液相色谱-紫外光谱（HPLC²UV）法对药材中乌头类生物碱进行提取和含量测定，能真实反映药材中药效和毒性成分。不同的炮制品中各生物碱含量差别较大，临床应用应有差别。
       【关键词】  提取方法 草乌 附子 乌头碱类生物碱
       在乌头类生药及炮制品中，生物碱成分既是药效成分同时也是毒性成分［1］，而且稳定性不好，很容易降解［2］，所以生物碱的提取方法在其成分分析中十分重要。目前有关生物碱的提取方法有很多［3～5］，但是，各种方法对双酯型生物碱的提取效率的比较研究尚无报道。中医临床常用的乌头类中药为附子的炮制品，市售的附子炮制品饮片按不同的炮制方法分为盐附子、黑附片、白附片、淡附子、熟附片及炮附子等［6］，但是，不同的炮制方法，必然会造成生物碱含量的不同，在使用上应有所区别。本文比较了7种提取方法对乌头类中药中3种双酯型生物碱的提取效率，并测定乌头类生药及其炮制品中乌头类生物碱含量，以期准确测定附子中生物碱,为保证此类中药的临床应用更为安全合理提供可靠的分析方法。
       1  仪器与试剂
       1.1  仪器LC-10A高效液相仪（Shimadzu，日本）；超声清洗器（Autoscience,天津）；高速离心机（Eppendorf，德国）；电子天平（Sartorius，德国）。
       1.2  试剂乌头碱，中乌头碱和次乌头碱对照品购自中国药品生物制品检定所。生附子、生草乌购自四川江油，制草乌、黑附片、白附片、盐附子、淡附子购自吉林省长春市吉深药店，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定均为正品。甲醇为色谱纯, 水为去离子水，乙醚、二氯甲烷等其他试剂为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  方法学考查
       2.1.1  色谱条件Agilent extended C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶0.1%三乙胺（65∶35）；流速为0.6 ml·min-1；检测波长为230 nm；柱温为30℃；样品经过0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液进样10 μl。
       2.1.2  标准曲线精密称取中乌头碱、乌头碱和次乌头碱对照品适量置于容量瓶中，加入二氯甲烷溶解并定容，得浓度为1.08 mg·ml -1的中乌头碱、1.12 mg·ml -1的乌头碱和1.22 mg·ml -1的次乌头碱标准品储备液。每种对照品溶液分别进样2，4，6，8，10 μl，高效液相色谱法测定。以浓度（μg·ml-1）对峰面积计算回归曲线。得到中乌头碱标准曲线方程为Y=20 672.0X-58 377.5，r=0.999 5；乌头碱标准曲线方程为Y=18114.2X-28 544.2，r=0.999 9；次乌头碱的标准曲线方程为Y=186 632X-13 386.7，r=0.999 3。说明乌头碱在5.6～112 μg·ml -1、中乌头碱在5.4～108  μg·ml -1，次乌头碱在6.1～122 μg·ml -1 的浓度范围内均呈良好的线性。
       2.1.3  重复性实验同一生草乌粉末按优选的提取方法操作，提取6份溶液，HPLC测定，记录乌头碱、中乌头碱、次乌头碱峰面积。乌头碱、中乌头碱和次乌头碱含量的RSD值分别为4.32%，3.57%和4.84%。说明方法重复性较好。
       2.1.4  回收率实验精密称取已知含量的生草乌粉末18份，每份0.2 g。第1个6份分别加入0.05 mg乌头碱，第2个6份分别加入0.4 mg中乌头碱，第3个6份分别加入0.2 mg次乌头碱，同法操作计算含量，乌头碱的平均回收率为91.2%，RSD值为2.84%；中乌头碱的平均回收率为90.4%，RSD值为3.12%；次乌头碱的平均回收率为92.8%，RSD值为3.10。表明方法回收率较好。
       2.1.5  稳定性实验同一生草乌粉末样品溶液保存于-80℃冰箱中，于放入冰箱后第4，8，12，18，24小时测定，计算含量。24 h内乌头碱、中乌头碱和中乌头碱含量的RSD值分别为5.21%，4.35%和6.24%。表明提取液在-80℃冰箱中24 h内较稳定。
       2.2  提取方法的优选
       2.2.1  水提氯仿萃取法 称生草乌2.0 g于带塞锥形瓶中，加30 ml蒸馏水，振荡6 h后，转移至50 ml离心管中，3 000 r·min-1离心20 min，取上清液，沉淀水洗2次，合并上清液，用10%氨水调pH值为10，分别加入15，5，5 ml氯仿萃取3次，合并氯仿层，蒸干。加甲醇溶解，定容至25 ml。
       2.2.2  酸提法称生草乌2.0 g于带塞锥形瓶中，加30 ml 0.04% HCl，振荡6 h，转移至50 ml离心管中，3 000 r·min-1离心20 min，取上清液，沉淀用0.04%HCl洗2次，合并上清液，加0.04%HCl定容至50 ml。
       2.2.3  酸提乙醚萃取法称生草乌2.0 g于带塞锥形瓶中，加30 ml 0.04% HCl，振荡6 h，转移至50 ml离心管中，3 000 r·min-1离心20 min，取上清液，沉淀0.04% HCl洗2次，合并上清液，用10%氨水调pH值为10，加入15，5，5 ml乙醚萃取3次，合并乙醚层，蒸干。加甲醇溶解，定容至25 ml。
       2.2.4  酸提氯仿萃取法称生草乌2.0 g于带塞锥形瓶中，加30 ml 0.04%HCl，振荡6 h，转移至50 ml离心管中，3 000 r·min-1离心20 min，取上清液，沉淀用0.04%HCl洗2次，合并上清液，用10%氨水调pH值为10，加入15，5，5 ml氯仿萃取3次，合并氯仿层，蒸干。加甲醇溶解，定容至25 ml。
       2.2.5  氨水乙醚冷浸法称生草乌2.0 g于带塞锥形瓶中，加4 ml10%氨水，加30 ml乙醚，振荡5 min，冷浸6 h，转移至50 ml离心管中，3 000 r·min-1离心5 min，取乙醚层，沉淀用乙醚洗2次，合并乙醚层，蒸干。加甲醇溶解，定容至25 ml。
       2.2.6   氨水乙醚超声提取法称生草乌2.0 g于带塞锥形瓶中，加4 ml 10%氨水，加30 ml乙醚，超声30 min，转移至50 ml离心管中，3 000 r·min-1离心5 min，取乙醚层，沉淀用乙醚洗2次，合并乙醚层，蒸干。加甲醇溶解，定容至25 ml。
       2.2.7   酸超声提氯仿萃取法称生草乌2.0 g于带塞锥形瓶中,加30 ml 0.04%HCl，超声30 min，转移至50 ml离心管中，3 000 r·min-1离心20 min，取上清液，沉淀5 ml0.04%HCl洗2次，合并上清液，用10%氨水调pH值为10，加入15，5，5 ml氯仿萃取3次，合并氯仿层，蒸干。加甲醇溶解，定容至25 ml，。
       
       采用“2.1.1”项下的色谱条件对上述7种提取方法所得样品进行含量测定。得到结果见表1。各种提取方法的提取率（3种生物碱之和）顺序为：氨乙醚冷浸>酸提>酸超声提氯仿萃取>氨乙醚超声提取>酸提氯仿萃取>酸提乙醚萃取>水提氯仿萃取。确定氨乙醚冷浸为最有效的提取方法。
       
       表1  不同提取方法双酯型乌头碱的含量（略）
       2.3  草乌、附子生药及炮制品的含量分析分别准确称取白附片、炮附子、黑附片、淡附子、生草乌、生附子、制草乌粉末各0.4 g，加10%氨水0.5 ml润湿，加乙醚10 ml，浸泡过夜，取乙醚层，药渣用乙醚1 ml洗2次，合并乙醚层，蒸干，加色谱纯甲醇定容至2 ml。采用“2.1.1”项下的色谱条件对样品进行测定。利用当日标准曲线计算提取液中3种双酯型生物碱的含量，每种样品均取3份平行操作。实验结果见表2。不同炮制方法得到的炮制品中各生物碱含量差别较大。生草乌、生附子及各炮制品中双酯型生物碱的含量顺序为，生草乌>生附子>制草乌>黑附片>淡附子>白附片>炮附子。
         
       表2  各种乌头类中药中乌头类生物碱含量（略）
       3  讨论
       
       效率较高的乌头类生物碱提取方法是氨乙醚和稀盐酸提取法，这是由于乌头碱类双酯二萜生物碱的极性较小，易溶于乙醚、氯仿等有机溶剂。虽然乌头类生物碱难溶于水，但是人们在服用乌头属中药时基本采用水煎煮的方法，所以本实验比较了分别以乙醚，氯仿和水为溶解的7种提取方法。
        
       水提取氯仿萃取法提取率最低，这是乌头类生物碱在水中的溶解度较低，不能全部被溶出的缘故。氨乙醚冷浸法的提取率最高，这是由于乌头类生物碱在碱性的环境下以游离型存在，能充分溶于有机溶剂而被萃取出来。其余方法的提取率均低于氨乙醚冷浸法。乌头类生物碱在酸性环境下成盐导致水溶性增大（张洪贵.《毒性乌头生物碱碱代谢产物研究》. 吉林大学2006博士生毕业论文），故酸提法的提取率较高，但是乌头碱在酸性水溶液中的溶解度仍然低于在乙醚中的溶解性。酸提乙醚萃取法和酸提氯仿萃取法由于在萃取的过程中，乌头类生物碱被分配在水层一部分，导致提取不完全，所以提取率要低于氨乙醚冷浸法。氨乙醚超声提取法和酸超声提氯仿萃取法是由于在超声的过程中，溶剂内部产生的热量导致不稳定的乌头类生物碱水解而使提取率下降。
       
       炮制品与生药相比较，提取液中双酯型生物碱含量明显减少，毒性大大降低。制草乌的各成分含量明显高于其它炮制方法，因此在使用时应适量。炮附子中双酯型生物碱含量非常低，中乌头碱、乌头碱、次乌头碱均未检出，因此在乌头类中药临床应用中总结出来的“仅炮附子能大量入药”，从化学成分分析上是合理的。
       【参考文献】
         　　［1］ 杨 姝,金振辉,羊晓东,等.乌头属植物的化学成分及药理作用研究进展［J］. 云南农业大学学报,2007,22(2)：293.
       
       ［2］ 黄勤安,张聿梅,何 轶,等. 乌头碱水解转化规律的研究［J］. 中国中药杂志, 2007,32(20):2143.
       
       ［3］ 徐建东,王洪泉,姜翠敏,等. 附子提取工艺的优化选择［J］. 辽宁中医杂志,2000,27(2):88.
       
       ［4］ 万里翔,张岳峰,侯大斌. 乌头总碱的纯化工艺及中乌头碱的纯化研究［J］. 安徽农业科学,2008,36(12):5044.
       
       ［5］ 赵 镭,唐 星. 附子总生物碱的提取纯化工艺［J］. 沈阳药科大学学报,2007,24(7):433.
       
       ［6］ 胡述文.附子的炮制及临床有效用量 ［J］. 医学文选,2005,24(2):26.