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       【摘要】 
       目的观察虎杖方剂对四氯化碳(CCl4)致大鼠肝损伤的保护作用。方法参照文献方法制备CCl4致大鼠肝损伤模型，实验分正常对照组、药物对照组、CCl4肝损伤组、药物预防组、药物不同剂量治疗组。测定肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量，血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）活性及血清一氧化氮（NO）与肿瘤坏死因子（TNF-α）水平，并进行肝组织学检查。结果CCl4致大鼠肝损伤组肝组织SOD活性明显降低，MDA含量显著升高（P<0.01）；血清ALT、AST、AKP活性及NO与TNF-α水平显著升高(P<0.01)。虎杖方剂本身对正常肝脏无损伤作用，而且虎杖方剂预防组与治疗组均能明显提高肝组织SOD活性，降低肝组织MDA含量；显著降低血清ALT，AST，AKP活性及NO与TNF-α水平(P<0.01)。肝组织学检查发现虎杖方剂能明显减轻CCl4引起的肝组织及肝细胞损伤。结论虎杖方剂本身对肝组织无明显损伤作用，通过抑制脂质过氧化、抑制TNF-α的表达和保护内皮细胞功能减轻CCl4引起的肝损伤。
       【关键词】  虎杖方剂 四氯化碳 肝损伤
       肝脏是机体主要的代谢器官，病毒性肝炎、毒物、药物等诸多因素可导致肝功能受损而影响其正常的代谢功能。肝功能出现障碍时，对机体代谢产生的有害物质的清除能力下降，严重者甚至可引起肝昏迷。虎杖方剂由咸宁市南山肝病研究所历经数年收集民间治疗肝病验方、经方、单方、秘方根据中医理论由虎杖、地榆、三白草等配伍蓬莪术按一定比例成方，用于防治病毒性乙型肝炎。本方剂中虎杖、莪术均有保肝护肝作用［1，2］。近年来研究发现一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等在肝损伤中起重要作用［3］，并且发现莪术在较大剂量时对肝有毒性作用［4］。虎杖等对肝损伤时NO和TNF-α的影响尚未见报道。为了保证临床用药的安全性和有效性，本实验就该方剂对四氯化碳致大鼠肝损伤的保护作用进行了观察。
       1  材料与方法
       1.1  动物健康Wistar大鼠，体重180～250 g，雌雄兼用。
       1.2  材料原生药加蒸馏水浸泡1 h后，煎煮1 h和30 min两次，合并煎液进行浓缩，得浓度为含生药100％的溶液，冰箱保存；四氯化碳（CCl4），分析纯，上海申鹤化学品有限公司产品，临用前用麻油配成50％的溶液；谷丙转氨酶试剂盒、谷草转氨酶试剂盒，上海生物制品研究所产品；SOD，MDA试剂盒，南京聚力生物医学工程研究所产品；NO，TNF-α试剂盒，武汉博士德有限公司产品。
       1.3  实验分组参照文献［5］方法建立大鼠肝损伤模型，60只Wistar大鼠分成6组，每组10只。正常对照组以生理盐水灌胃（1 ml/kg，2次/d，连续6 d）；药物对照组以药物灌胃（1 ml/kg，2次/d，连续6 d）；肝损伤组以50％CCl4灌胃（1 ml/kg，1次/d，连续 3 d），第4天用生理盐水灌胃（1 ml/kg，2次/d，连续6 d）；药物预防组为药物灌胃（1 ml/kg，2次/d，连续6 d），第7天开始用50％CCl4灌胃（1 ml/kg，1次/d，连续3 d）；药物Ⅰ组以50%CCl4灌胃（1次/d）连续3 d，第4 d开始用药物灌胃（1.0 g/kg，2次/d，持续6 d）；药物Ⅱ组以药物灌胃2 ml/kg，余同药物Ⅰ组。
       1.4  生化测定与组织学观察所有动物于末次处理后2 h断头处死、取血、分离血清，按试剂盒说明用赖氏法测定血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）活性；用磷酸苯二钠法测定血清碱性磷酸酶（AKP）活性；用酶联吸附免疫法测定血清TNF-α水平；用硝酸还原酶法测定NO水平。同时取部分肝脏组织，用生理盐水制成10％的组织匀浆，按试剂盒说明测定SOD活性及MDA含量，另取肝组织用10％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，在光镜下进行组织学观察。
       2  结果
       2.1   虎杖方剂对CCl4肝损伤大鼠血清ALT，AST，AKP活性的影响肝损伤组血清ALT，AST及AKP水平明显高于正常对照组（P<0.01），表明CCl4肝损伤模型制作成功。药物对照组与正常对照组比较，血清酶活性无显著性改变（P>0.05），提示在实验给药剂量时药物本身不引起肝脏明显损伤，对正常肝功能无明显影响。无论预防性用药还是治疗性用药，均显著降低血清ALT，AST及AKP活性（P<0.01），其中以降低AST与ALT作用更明显，结果表明药物对CCl4肝损伤大鼠肝脏有保护作用。结果见表1。
       表1  虎杖方剂对大鼠血清ALT、AST及AKP活性的影响（略）
       与正常对照组比较，1)P<0.01；与肝损伤组比较，2)P<0.01
       2.2   虎杖方剂对大鼠肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的影响肝损伤组SOD水平显著降低，MDA水平明显升高，药物治疗组和预防组均明显降低SOD水平，降低MDA水平，提示药物能通过抑制脂质过氧化反应对肝脏产生保护作用，减轻CCl4对肝脏的损伤。结果见表2。
       表2  虎杖方剂对大鼠肝组织SOD活性及MDA含量的影响（略）
       与正常对照组比较，1)P<0.01；与肝损伤组比较，2)P<0.01
       2.3  虎杖方剂对CCl4致肝损伤大鼠血清NO与TNF-α水平的影响与正常组比较，肝损伤组血清NO和TNF-α水平显著增高，治疗组或预防组血清NO和TNF-α水平均明显降低，表明虎杖方剂保护CCl4引起的肝损伤与抑制NO合成和分泌，以及抑制TNF-α的表达有关，结果见表3。
       表3  虎杖方剂对CCl4致肝损伤大鼠血清NO与TNF-α水平的影响（略）
       对照组比较，1)P<0.01；与肝损伤组比较，2)P<0.01,3)P<0.05
       2.4  虎杖方剂对CCl4致肝损伤的组织学观察光镜下观察，肝损伤组肝小叶结构模糊，肝索排列紊乱，肝细胞肿胀明显，胞浆疏松，大部分肝血窦变窄，甚至闭塞不通，有淤血改变，坏死范围大，呈桥状或带状坏死。药物治疗组和预防组，病变较肝损伤组明显减轻，肝细胞轻度浊肿，病变仅限于肝小叶周边区，呈点状或局灶样坏死，多数肝血窦显露，开放通畅，内质网、线粒体等细胞器数目和形态恢复接近正常，肝细胞增生活跃，双核多见。
       3  讨论
       
       四氯化碳是一种对肝细胞有严重毒性作用的化学物质，在体内经代谢产生自由基CCl3-，通过自由基介导的脂质过氧化作用破坏肝细胞器（如细胞膜、内质网、线粒体、溶酶体、细胞核），导致肝细胞变性坏死，转氨酶大量漏出；同时四氯化碳可直接抑制肝脏微粒体混合功能酶［6，7］(如CYP1A1、CYP1A2、CYP2B1和CYP2E1等），最终引起肝功能受损而降低。另外，在自由基的作用下，可激活单核细胞和巨噬细胞产生大量的细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF-α）等，TNF-α参与炎症反应直接损伤血管内皮细胞，导致内皮细胞功能紊乱。内皮细胞在一氧化氮合酶（NOS）的作用下合成并分泌内皮舒张因子一氧化氮（NO），合成NO的酶有两种，即原生型和诱生型。原生酶合成的NO有舒张血管、传递信息、抑制血小板聚积等作用，而诱生酶合成的NO则与免疫及细胞毒有关，造成组坏死和细胞死亡，进一步加重肝损伤。有研究表明［3］，诱导型NOS是肝脏的主要形式，并且TNF-α在肝脏炎症反应中起非常重要的作用。
       
       本实验结果显示，虎杖方剂能明显对抗CCl4引起的大鼠肝损伤，其保肝护肝作用系通过虎杖中的白藜芦醇苷和莪术中的莪术酮抗脂质过氧化、抑制TNF-α的表达和保护内皮细胞功能产生，与文献报道的一致［8］，而且该方剂本身对肝脏无明显损伤作用。本实验还观察到预防给药对肝脏虽有保护作用，但不及治疗组，其原因系药物在体内经代谢和消除而使药效降低。
       【参考文献】
         　［1］ 杨溪琳. 虎杖的临床应用探析［J］. 云南中医中药杂志,2007,28(10):48.
       
       ［2］ 薛 岚.中药虎杖的药理研究进展［J］.中国中药杂志，2000，25(11)：651.
       
       ［3］ 曾令兰，郑曲波，罗端德，等.慢性肝炎及肝硬化患者一氧化氮与内皮素和丙氨酸转氨酶相互关系的研究［J］.临床消化病杂志,1999，11(3):110.
       
       ［4］ 陈 斌，孙克伟，谢凤英，等.莪术治疗慢性肝损伤时的肝毒性作用研究［J］.中西医结合肝病杂志,2003，13(1):20.
       
       ［5］ 刘晓丽，刘春霞，刘红军，等. 小鼠四氯化碳急性中毒性肝损伤模型制备方法探讨［J］.新乡医学院学报,2001，18(1):30.
       
       ［6］ 陈小丽，周炯亮，杨杏芬，等. 四氯化碳抑制大鼠肝细胞色素P450同功酶的研究［J］.卫生毒理学杂志,2000，14(4):214.
       
       ［7］ Bruckner JV, Ramanathan R, Lee KM, et al. Mechanisms of Circadian Rhythmicity of Carbon Tetrachloride Hepatotoxicity［J］.Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2002,300(1):273.
       
       ［8］ 李晓娟，王宗伟. 肿瘤坏死因子α天然抑制剂［J］.国外医学·植物药分册，2002，17(2)：47.