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       【摘要】 
       目的探讨皱皮木瓜总黄酮（FLC）的镇痛作用及其镇痛机制。方法利用小鼠热板、扭体法模型和兔耳皮下K+ 渗透外周致痛模型，观察FLC的镇痛作用，并分析与Ca2+的关系。结果FLC不仅具有全身镇痛作用，还具有外周镇痛作用；其全身及外周镇痛作用可被CaCl2拮抗，被EGTA所加强。5%，10%和20%FLC呈浓度依赖性抑制50 mmol·L-1 K+诱导蟾酥坐骨神经Ca2+含量增加；10%FLC抑制10-5mmol·L-1NE诱导蟾酥坐骨神经Ca2+含量增加。结论FLC的镇痛作用机理可能与其抑制神经组织钙通道和非神经组织钙通道，减少致痛介质释放等因素有关。
       【关键词】  皱皮木瓜总黄酮 钙离子 坐骨神经 镇痛作用
       植物中的黄酮类化合物具有多种药理活性。近年来发现芦丁、银杏叶总黄酮、金丝桃苷和黄芩苷等生物黄酮类化合物均有较强的镇痛作用［1～5］。本实验室以前的研究发现皱皮木瓜的乙醇提取物具有镇痛作用［6］。为了进一步寻找其中的有效部位，本文利用皱皮木瓜总黄酮组分，对其镇痛作用进行了深入的实验研究。
       1   材料
       
       颅痛定（Rotundine，Rot），山西云鹏制药有限公司出品，批号20060402；CaCl2 ，武汉化工试剂有限公司产品；乙二醇双醚四乙酸（EGTA ），华中科技大学提供； 硝苯地平 （Nifedipine，Nif），湖北华中药业有限公司出品，批号20070122; 皱皮木瓜总黄酮（FLC）由三峡大学天然产物研究与利用实验室提供，经酒精回流、大孔吸附树脂分离纯化，临用时配成相应浓度备用。其他试剂均为市售产品。
       2  方法
       2.1  小鼠热板法取雌性昆明种小鼠50只，普通清洁级，体重18～22 g，选择其基础痛阈在10～25 s之间，随机分为5组，每组10只，腹腔注射给药。分组及用药剂量见表1。调节热板仪温度至55℃，以雌性小鼠接触热板至开始舔后足的潜伏期为基础痛阈指标，分别测得小鼠给药后30，60，90 min痛阈值。
       2.2  小鼠扭体法取昆明种小鼠50只，普通清洁级，雌雄不拘，体重18～22 g，随机分为5组，每组10只。分组及用药剂量见表2。各组小鼠给药40 min后，腹腔注射0.6%冰醋酸0.2 ml/只，观察注射醋酸后30 min内扭体反应（后肢伸直，背部抬高，腹部凹陷）次数作为致痛的指标。
       2.3   家兔耳皮下K+  渗透外周致痛模型  实验取家兔30只，体重1.5～2.0 kg，随机分5组，分组及用药剂量见表3。置家兔于兔盒中，在耳根部中央动脉顺血流方向用7#针头刺入后，立即注入0.5 ml肝素进行局部抗凝处理并固定；将耳背部内、外两侧耳缘静脉近心端分别用7#注射针头沿静脉血流方向逆向刺入并引流至体外，用蛙心夹夹住静脉以阻断其回流。在耳尖部固定一金属圈，直径约0.8 cm，充以饱和氯化钾溶液棉球，作为刺激电极正极，在耳根部固定一相同金属圈，充以生理盐水棉球，作为参考电极，两电极连上BL-420E+生物机能实验系统，逐步加大刺激电流，以引起家兔挣扎时的最小刺激电流为痛阈指标,制成兔耳皮下K+渗透外周致痛模型，分别测定并记录给药前后痛阈，按以下公式，求出镇痛效应。
       
       镇痛效应（%）=（给药后痛阈－给药前痛阈）/给药前痛阈×100%
       
       同法测得给药前后对侧兔耳痛阈值的变化，以排除药物从侧枝循环回流至全身产生的全身镇痛效应。
       2.4   坐骨神经钙含量的测定按文献方法制备蟾蜍坐骨神经标本。标本称重，随即将神经标本浸在4℃的任氏液中1 h，分别加入50 mmol·L-1 KCl和10-5mol·L-1 NA，刺激钙通道开放，以增加钙离子内流，继续在4℃任氏液中保存1 h后取出标本，用无钙任氏液冲洗2次，以冲去标本表面上的钙离子，滤纸吸干，放入去离子水清洗的坩锅内待消化。FLC组则在未使用激动剂前将标本浸在不同浓度的FLC中30 min，再分别放入上述相同的激动剂中，后续处理相同。所有标本分别加入混合酸（硝酸0.9，高氯酸0.1）1.0 ml在电热板上徐徐加热，消化至无色，待高氯酸冒烟时取下，加入2%HCl溶解，再加入500 ppm镧盐(促钙释放剂)，定溶后待测。采用HITACHI Z-2000型原子吸收分光光度计测定（测定波长42207 nm，灯电流10 mA，狭缝0.7 nm）。见图1～2。
       
       2.5   统计学处理  所有数据依据SPSS10.0 版统计软件进行t检验分析处理。
       3   结果
       3.1  FLC对热板法致痛实验小鼠痛阈的影响结果见表1。
       表1  FLC对实验小鼠痛阈的影响（略）
       与NS比较, ＊P<0.05；与20%FLC比较，△P<0.05；n=10
       
       实验结果表明，2.0g·kg-1FLC明显延长小鼠舔足潜伏期，其延长效应能被EGTA增强，被CaCl2所拮抗。
       3.2   FLC对扭体法致痛实验小鼠扭体次数的影响结果见表2。
       表2  FLC对小鼠扭体次数的影响（略）
       与NS比较,＊P<0.05, ＊＊P<0.01
       
       结果表明，FLC明显降低小鼠扭体反应次数，表明对化学致痛模型也具镇痛作用，且镇痛作用与FLC剂量存在依赖关系。
       3.3   FLC对家兔耳皮下K+ 渗透外周致痛模型的影响见表3。
       表3  FLC对实验家兔的镇痛效应（略）
       与NS比较, ＊ P<0.05;与8%FLC比较，＊＊P<0.05
       
       由表3可见 FLC对兔耳皮下K+ 渗透致镇痛模型可显著提高痛阈，其镇痛作用能被EGTA增强，被CaCl2所拮抗。表明FLC也有很强的外周镇痛作用，且镇痛作用与钙离子有关。经测给药前后对侧兔耳痛阈值无明显改变。
       3.4   FLC对坐骨神经钙含量的影响见图1～2。
       图1  FLC对蟾蜍坐骨神经钙含量的影响（略）
       图2  FLC对蟾蜍坐骨神经钙含量的影响（略）
       
       由图1可见，10-5 mol NA+10% FLC与10-5 mol NA组钙离子比较明显降低（P＜0.05），而NA+10-4 mol Nif组降低并不显著。5%、10%和20%的FLC可浓度依赖性降低由50 mmol K+所诱发的坐骨神经钙含量降低（P＜0.05）。见图2。说明FLC对电压依赖性的钙通道的阻滞作用大于受体操纵性钙通道。
       4  讨论
       
       皱皮木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai的成熟果实，主产于安徽、湖北、四川、浙江等地，经植化研究分析，皱皮木瓜的主要化学成分为有机酸、皂苷及黄酮类［7］。皱皮木瓜作为一种常用中药,味酸、温,入肝、脾经, 有舒肝止痛、祛风除湿之功效，可用于预防和治疗风湿病、痢疾和肠炎等。木瓜成分复杂，药理学作用广泛。本实验将皱皮木瓜黄酮作为研究有效部位。
       
       实验表明，FLC具有全身和外周镇痛作用。研究发现无论对小鼠热板模型，还是对兔耳皮下K+ 渗透外周致痛模型，均能清楚表明CaCl2可拮抗而EGTA可加强FLC的镇痛作用，这就提示FLC镇痛作用的机理可能与Ca2+有联系。Kavaliers等发现钙通道阻滞剂维拉帕米有一定的镇痛作用，而钙通道激动剂BAYK8644具有显著的痛敏作用。通过调节Ca2+内流而调控痛觉产生将是寻找有效镇痛药的新的途径。
       
       本研究采用热板法(热刺激)和扭体法(化学刺激)不同动物模型观察了FLC的镇痛作用。热板法反映的是躯体体表痛，而扭体法代表的是内脏痛。热板法引起的是时相性急性痛，而扭体法引起的是紧张性的病理性疼痛［8］。本实验中，FLC无论对醋酸所致雌性小鼠扭体反应的内脏痛、还是对热板法所致躯体体表痛均具镇痛作用。提示FLC在镇痛作用上无特异性，即对紧张的病理性疼痛（内脏痛）和对时相性急性痛（体表痛）无明显差异。
       
       CaCl2部分拮抗FLC的镇痛作用提示：Ca2+对FLC的镇痛作用的拮抗可能与钙离子内流有关。钙通道有L、N、T三个亚型，维拉帕米等经典的抗钙剂虽可阻断经L型通道钙离子内流，但不能阻断N、T型通道的钙内流，结果神经细胞钙离子水平仍然较高，所以维拉帕米本身无明显的镇痛作用，而FLC的镇痛效应可能与其非选择性的阻断钙通道有关。
       
       文献报道神经组织中也存在钙通道，其调节着神经递质的释放、树突神经元的动作电位、行为及节律活动。神经末梢可能存在着多种痛介质的受体或作用位点，而这些受体或位点偶联着钙通道，当痛介质兴奋其相应受体或作用位点时，钙通道开放，Ca2+内流增加，当细胞内钙离子浓度增高到一定程度时，兴奋了痛感受器，产生痛感受器电位，形成痛冲动传入中枢，而FLC可能与阻滞钙通道的多个亚型，影响钙离子内流，因而使痛感受器不能兴奋和通过阻滞钙离子内流，减少神经组织和/或非神经组织致痛介质的释放而产生镇痛作用有关。
       【参考文献】
         　　［1］ 张晨峥，毛甜甜，姜 鸣，等.曲克芦丁的镇痛作用研究［J］.医学新知杂志，2005，15（3）：31.
       
       ［2］ 张 黎，赵春晖，陈志武，等. 银杏叶总黄酮的镇痛作用及机制探讨［J］. 安徽医科大学，2001，36（4）：263.
       
       ［3］ 章家胜，陈志武，王 瑜，等.金丝桃甙脊髓镇痛作用及机制研究［J］. 安徽医学，1998，19（5）：3.
       
       ［4］ 左 亮. 黄芩提取物抗炎镇痛耐氧及抗疲劳作用的研究［J］.时珍国医国药，2007，18（9）：2157.
       
       ［5］ 宋小平，陈志武，张建华.映山红总黄酮的镇痛作用［J］. 安徽医科大学学报，2006，41（4）：427.
       
       ［6］ 柳 蔚，杨兴海，等. 资木瓜乙醇提取物镇痛抗炎作用的实验研究［J］.四川中医，2004，22（8）：7.
       
       ［7］ 吴 虹,魏 伟,吴成义.木瓜化学成分及药理活性的研究［J］.安徽中医学院学报，2004，23（2）：62.
       
       ［8］ Cull-Candy S，Brickley S，Farrant M.NMDA receptor subunits:diversity，development and disease［J］.Curr Op Neurobiol，2001，11(3):327.