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       【摘要】 
       目的观察芪参益气滴丸对急性心肌梗塞（AMI）大鼠不同时间点肿瘤坏死因子（TNF-α）表达的影响。方法制备AMI模型大鼠，随机分成假手术组、AMI模型组、芪参益气滴丸治疗组〔3.5 mg/(100 g·d)芪参益气滴丸混悬液灌胃给药〕、卡托普利治疗组［1.012 5 mg/（100 g·d）卡托普利悬浊液灌胃给药］，每组又分4个时点(3 d、2周、4周、8周)，共16个组，每组9只。于实验结束后处死动物,分别取大鼠梗死区及非梗死区心肌检测TNF-α的mRNA表达水平。结果芪参益气滴丸治疗组与AMI组比较，在梗塞区和非梗塞区3 d时芪参益气滴丸治疗组TNF-α mRNA表达降低，2，4，8周时与AMI组同期比较降低，有显著性差异（P<0.05），但仍高于假手术组；卡托普利治疗组，在2，4，8周时，梗塞区和非梗塞区TNF-α mRNA表达与AMI组比较有所下降，两组之间有显著性差异（P<0.05）；芪参益气滴丸治疗组与卡托普利治疗组两组比较，芪参益气滴丸治疗组3 d，2周，4周，8周与同期卡托普利治疗组比较梗塞区TNF-α mRNA表达有显著性差异（P<0.05），芪参益气滴丸治疗组下降显著；在非梗死区3 d，2周卡托普利治疗组较芪参益气滴丸治疗组下降明显，4，8周时两组之间未显示出差异。结论 早期应用芪参益气滴丸可抑制AMI后炎症反应，减轻了心肌损伤程度，保护心脏功能。
       【关键词】  芪参益气滴丸 急性心肌梗塞 肿瘤坏死因子 炎症反应
       芪参益气滴丸主要成分为黄芪、丹参、三七、降香组成，具有益气通脉，活血止痛的功效，临床上广泛用于治疗心血管疾病。本研究通过建立大鼠急性心肌梗塞(AMT)模型，观察芪参益气滴丸对肿瘤坏死因子（TNF-α）的抑制作用，探讨其减轻AMI后心肌损伤的机制，为芪参益气滴丸防治AMI开辟更为广阔的应用前景。
       1  材料和方法
        1.1  动物  Wistar大鼠，雄性,体重200～290g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2007-0001。
        1.2  药品、试剂及仪器 芪参益气滴丸药物，由天士力医药集团公司提供（批准文号：国药准字Z20030139）。卡托普利药物由施贵宝药品公司提供（批准文号：国药准字H31022986）。TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0由宝生物工程（大连）有限公司提供。Trizol由Invitro Gen公司提供。主要仪器设备包括：PCR仪（Hybaid Limited Equipent class1，英国）、紫外分光光度计 uv－530（BECKMAN公司）、DDY-11B型三恒电泳仪（北京六一仪器厂）、凝胶成像系统 （英国 syngene公司）。台式低温高速离心机（BECKMAN公司）。
        1.3  动物模型制备 按照文献方法［1］稍加改进,结扎大鼠左冠状动脉前降支(LAD)建立AMI模型。手术前后均记录体表心电图，以Ⅱ导ST段弓背向上抬高0.2 mm以上为结扎成功的标志。另设假手术组36只，其方法除不结扎冠状动脉外，余操作与AMI模型组动物相同。于术后给予青霉素4万U，肌肉注射1次/d，共3 d。
        1.4  分组及给药 24 h存活大鼠随机分为假手术组、AMI模型组、芪参益气滴丸治疗组、卡托普利治疗组，每组又分4个时点(3 d，2周，4周，8周)，共16个组，每组9只。芪参益气滴丸组大鼠实验前称取一定量的浸膏，用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成3.5 mg/(100 g·d)浓度的芪参益气滴丸混悬液，按3.5 mg/（100 g·d）给药。卡托普利组用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成1.0125 mg/ml浓度的悬浊液，按1.012 5 mg/（100 g·d）给药，AMI模型组、假手术组予以生理盐水灌胃，至实验结束。
        1.5  心肌总RNA的提取和细胞因子的检测
        1.5.1  心肌总RNA的提取于3 d、2周、4周、8周实验结束后处死动物,分别取大鼠梗塞区及非梗塞区心肌100 mg用Trizol法提取总RNA，提取的总RNA用紫外分光光度仪分别测定A260,A280数值，所测得RNA样品吸光度A260/A280为1.8～2.0。
        1.5.2  RT-PCR方法检测mRNA的水平PCR具体步骤是： 94℃预变性2 min，PCR扩增35个循环(94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸2  min)。PCR产物经2%琼脂糖电泳分析结果,用光密度扫描计算TNF-α与内参的比值。引物序列参照Genebank提供的cDNA序列,用Primer 5·0设计,由上海生物工程公司合成。TNF-α：sense5′-caa gag ccc ttg ccc taa-3′；antisense5′-cag agc aat gac tcc aaa gta-3；退火温度58.1℃；产物长度180bp。内参β-actin：sense5′-cca acc gtg aaa aga tga cc-3；antisense5′-cag gag gag caa tga tct tg-3′；退火温度58.1℃；产物长度660bp。
        1.6  统计学方法 实验数据以(±s)表示，采用SPSS 10.0软件包，做单因素方差分析进行组间比较。
       2  结果
        实验结果显示，AMI大鼠TNF-α的mRNA在梗塞区和非梗塞区与假手术组比较均显示高度表达，有显著性差异（P<0.05）；梗塞区3 d时TNF-α就高度表达，2周时仍高度表达，4周，8周时TNF-α的mRNA表达量有所下降；非梗塞区3 d时TNF-α就也高度表达，2周时仍升高，4，8周时有所降低，但仍高于假手术组。
        芪参益气滴丸治疗组与AMI组比较，在梗塞区和非梗塞区3 d时芪参益气滴丸治疗组TNF-α mRNA表达降低，2，4 ，8周时与AMI组同期比较降低，有显著性差异（P<0.05），但仍高于假手术组。
        卡托普利治疗组，在2，4，8周时，梗塞区和非梗塞区TNF-αmRNA表达与AMI组比较有所下降，两组之间有显著性差异（P<0.05）。
        芪参益气滴丸治疗组与卡托普利治疗组两组比较，芪参益气滴丸治疗组3 d，2，4，8周与同期卡托普利治疗组比较梗塞区TNF-α mRNA表达有显著性差异（P<0.05），芪参益气滴丸治疗组下降显著；在非梗塞区3 d，2周卡托普利治疗组较芪参益气滴丸治疗组下降明显，4，8周时两组之间未显示出差异。结果见表1和图1～2。表1  大鼠心肌梗塞后TNF-αmRNA表达量比较与假手术组比较，*P<0.05；与AMI组比较，△P<0.05；与卡托普利治疗组比较，#P<0.05；n=9
       3  讨论
        近年来炎症细胞因子在心室重构中的作用越来越受到重视，大量临床和实验研究都证明AMI后TNF-α、白细胞介素-1( IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)等细胞因子显著升高，参与AMI后心肌的损伤。其中TNF-α的作用较为重要。心肌坏死后补体被激活，氧自由基产生，触发由TNF-α释放为起始的细胞因子级联反应，并使趋化因子上调，最终导致愈合和瘢痕形成［2］。
        TNF-α主要由单核巨噬细胞分泌，心肌细胞和肥大细胞也是TNF-α的重要来源。TNF-α主要通过以下3个方面参与心肌损伤［3］：①TNF-α参与的炎症反应：TNF-α激活血管内皮细胞合成和表达细胞间黏附因子，加剧心肌的炎症反应；TNF-α可作为其他一些炎症因子的上游激活物诱导单核细胞产生IL-6和IL-1,分别参与各自在炎症反应中的作用；②TNF-α对心肌的直接毒性：TNF-α能诱导IL-1的产生，并和IL-1协同产生对心脏的直接毒性，主要表现为对心肌收缩功能的抑制，降低心脏的射血分数(EF)，双心室扩张，全身血管阻力下降。TNF-α对心肌收缩功能的抑制主要在于TNF-α破坏L型钙通道，导致Ca2+内流障碍；另外TNF-α、IL-1可通过作用于核因子κB(NF-κB),激活血管平滑肌细胞、巨噬细胞和心肌细胞核内诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)基因表达的启动子，使得iNOS表达增强，产生的大量一氧化氮(NO)破坏心肌细胞肌丝上的神经鞘氨醇，使得肌丝对内流的Ca2+不敏感，从而抑制心肌的收缩功能。③TNF-α对心肌细胞凋亡的诱导：心肌缺血再灌注过程中产生的大量TNF-α能够与心肌细胞膜上的TNF受体结合，激活细胞内天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)，通过效应子Caspase-10,7,6的逐级级联放大作用，最终激活Caspase-3，导致心肌细胞凋亡，这也是AMI后心肌损伤的机制之一。因此，抑制TNF-α的过度表达对减轻心肌损伤具有重要意义。    中药芪参益气滴丸主要成分为黄芪、丹参、降香、三七组成。方中黄芪，具有调节细胞因子介导的心肌损伤的作用，吴凡等［4］在用黄芪治疗病毒性心肌炎（VCM）小鼠后发现，VCM小鼠心脏组织中IL-2及TNF-α的mRNA表达下降，白介素-10（IL-10）mRNA表达则增高，表明黄芪通过调节细胞因子在心脏组织的表达而发挥其治疗作用。三七总皂苷为三七的主要有效成分,近年研究发现三七总皂苷对多种实验性炎症模型具有良好的抗炎活性。三七总皂苷具有很强的抗炎作用，可促进抑制性核转录因子（NF-κB）的表达从而抑制相关炎症因子的生成有关［5］。三七总皂苷可减少心肌缺血再灌注损伤时TNF-α的生成［6］。众多实验证明，丹参可作为一种疗效显著的抗炎药物，对白细胞的激活、黏附、趋化等过程起抑制作用。临床上,洪永敦等［7］研究发现香丹注射液显著降低急性冠脉综合征患者CRP，IL-6，TNF-α水平,表明其对急性冠脉综合征的炎症反应有明显抑制作用。因此，从芪参益气滴丸的组方分析，可以显示益气活血中药芪参益气滴丸具有抗炎、调节免疫、减轻炎症反应对组织的损伤的作用。本研究表明,AMI模型组中TNF-α的含量明显高于芪参益气滴丸治疗组、卡托普利治疗组和假手术组,而芪参益气滴丸组TNF-α的释放明显减少,减少了AMI后TNF-α的生成,即降低了氧化损伤和炎症因子生成,从而减轻了心肌损伤，保护心脏功能，且作用优于卡托普利。
        AMI后的心室重构与许多因素有关,多种药物的联合应用特别是中西药物如何联合使用将是需要我们进一步研究的重要课题。通过拮抗炎症,特别是早期应用中药可能对梗死区炎症与心肌的修复具有重要作用,这对于延缓和改善心室重构,预防心力衰竭有重要意义［8］。
         
       【参考文献】
         ［1］ 孔 强,华 琦,杨新春,等.通心络对大鼠心梗后心肌MMP-9及TIMP-1表达作用的研究［J］.中国中医基础医学杂志,2007,13(11)：830.
       
       ［2］ Rangogiannis N G，Smith CW，Entman ML.The inflammatory response in myocardial infarction［J］.Cardiovasc Res,2002,53:31.
       
       ［3］ 赵献明,李 浪.急性心肌梗死心肌损伤的免疫学机制研究进展［J］.临床荟萃，2007，22(3)：221.
       
       ［4］ 吴 凡，邱汉婴，董继华，等.黄芪对病毒性心肌炎心脏细胞因子mRNA表达的影响［J］.临床心血管病杂志，2004，20（3）:165.
       
       ［5］ 胡志洁，张志耘.三七总皂苷对心脑血管的药理作用研究［J］.天津药学，2006，18(6)：51.
       
       ［6］ 张丽君，耿志辉.三七总皂苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护研究［J］.吉林医学,2007,28（11）:1261.
       
       ［7］ 洪永敦，吴 辉，莫鸿辉，等.香丹注射液治疗急性冠脉综合征的临床研究及其对炎症指标的影响［J］.中药新药与临床药理，2004,15(6)∶425.
       
       ［8］ 杜武勋，刘长玉，刘 梅，等. 心肌梗死后免疫炎症反应及中西药物治疗［J］.中国中西医结合杂志,2007,27(9):860.