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       【关键词】  恩五叶蜜；,,绞股蓝；,,过氧化氢同功酶谱
       摘要：目的研究“恩五叶蜜”绞股蓝过氧化氢同功酶，探讨其指纹鉴定依据。方法采用聚丙烯酰凝胶电泳法。结果它有四条酶带；Rf值为0.18~0.32；酶带宽0.2~0.4。结论可以作为它的指纹鉴定依据。
       关键词：恩五叶蜜；  绞股蓝；  过氧化氢同功酶谱
       “恩五叶蜜”绞股蓝品种选育是湖北民族学院绞蓝股课题组1993年在省教育厅立项的科研项目，1999年通过国家种子部门鉴定。它比绞股蓝原种含的绞股蓝总皂苷高28%，口感不苦，为蜜甜味，用其生产的保健饮品深受男女老少欢迎。已作为特种经济作物在鄂西南地区推广［1］，但未有它的过氧化氢同功酶研究报道，生产上缺少它的指纹鉴定依据，不能准确鉴别真伪品种。本研究利用聚丙烯酰凝胶电泳法对恩五叶蜜绞股蓝进行了过氧化氢同功酶研究。
       1  材料、仪器与方法
       1.1  材料本实验所用的“恩五叶蜜”绞股蓝鲜活株取自湖北民族学院生科院苗圃。
       1.1.2  药品单体储液，称取30 g丙烯酰胺和0.8 g甲叉双丙烯酰胺用重蒸馏水溶解后定容至100 ml转入棕色试剂瓶冰箱保存；10%过硫酸铵，称取5 g过硫酸铵用重蒸馏水溶解后定容至50 ml转入棕色试剂瓶冰箱保存。（不得超过1周）；分离胶缓冲溶液（3   mol・L-1Tris-HCl pH8.8）称取36.6 g Tris 加30 ml mol/L Hcl.再用酸度剂调 pH至8.8定容至100 ml试剂瓶冰箱保存；浓缩胶缓冲溶液（0.5 mol・L-1Tris-HCl pH6.8）称取6.0 g Tris溶于40 ml双蒸馏水中用1 mol/L HCl调至pH6.8定容至100 ml试剂瓶冰箱保存；电极缓冲溶液（0.25 mol・L-1Tris，1.92  mol・L-1甘氨酸，pH8.3）称取3.0 g Tris，14.4 g甘氨酸，重蒸馏水溶解后定溶于100 ml。用时稀释10倍；提样缓冲溶液，稀释4倍的浓缩胶缓冲溶液，加水14.5 ml，1.5%琼脂糖2 ml；过氧化氢同功酶染色液，称取0.1 g联苯胺加少量无水乙醇溶解，依次加入5 mol/L HAC 10 ml，5 mol/L NaAC10 ml，重蒸馏水70 ml，最后加入3~5滴双氧水。
       1.3  仪器DY-602V稳流稳压电泳仪；V16-夹心式垂直电泳槽；真空干燥箱及真空；低温高速离心机；电子天平；蒸馏水器；水浴锅；冰箱；微量进样器；解破刀。
       1.4  样品制备采取绞股蓝成熟叶片，取中部，去叶脉，准确称取1 g加入少量提样缓冲溶液在冰浴中研磨成浆，取此液在低温4℃高速离心机上15 000 r/min离心10 min，取上清液0.5 ml加入等体积样品处理液，混合后储藏在冰箱中备用。将制好的电泳槽放入冰箱内，向上下槽注入电极缓冲溶液，取下样品梳（注意不要拉断样槽隔墙）将微量进样器针头插入样槽下部，慢慢进样。
       1.5  凝胶制备采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统制胶，分离胶浓度为7.5%（pH8.9），浓缩胶浓度为4%（pH6.8），电极缓冲溶液（pH8.3）。
       1.6  电脉操作上样量每槽20 μl，采用 DY-602V稳流稳压电泳仪及V16-夹心式垂直电泳槽，上槽接负极，下槽接正极，接通电源使用电压220 V，电流强度15~20 Ma，在4℃冰箱中进行电泳至溴酚蓝颜色达到凝胶前尚为止时将电压电流调至零后断电，结束后用过氧化氢同功酶染色液染色、照相、最后用7%醋酸保存。
       1.7  酶谱分析依据测量各酶带的泳动距离记录各酶带的活性并计算出迁移率 Rf值（Rf为过氧化氢同功酶带迁移距离/溴酚蓝迁移距离）。依活性度按酶带显示程度分2极：酶带深色 a、浅色 b［2，3］。
       　　2  结果
       2.1  “恩五叶蜜”绞股蓝过氧同功酶有P1，P2，P3，P4四条。结果见图1。
       2.2  “恩五叶蜜”绞股蓝过氧化氢同功酶P1，P2，P3为深色，P4为浅色。
       2.3  “恩五叶蜜”绞股蓝过氧化氢同功酶带宽度。P1为0.8 cm，P2为0.6 cm，P3为0.3 cm，P4为0.4 cm，说明“恩五叶蜜”绞股蓝过氧化氢同功酶的种类比较丰富。
       图1  “恩五叶蜜”绞股蓝过氧化氢同功酶谱（略）
       2.4  “恩五叶蜜”绞股蓝过氧化氢同功酶相对迁移率 P1为0.62，P2为0.5，P3为0.42，P4为0.4。结果见表1。
       表1  “恩五叶蜜”绞股蓝过氧化氢同功酶谱带颜色、数据（略）
       　　3  讨论
       3.1  同功酶是研究生物品种指纹及品种间亲缘关系的一门科学。本研究得出的“恩五叶蜜”绞股蓝过氧化氢同功酶谱可以作为“恩五叶蜜”绞股蓝品种真伪生化鉴定的理论依据。
       3.2  制作“恩五叶蜜”绞股蓝过氧化氢同功酶谱应选用其成熟的新鲜叶片鲜采鲜用和及时低温分离点样跑酶谱，否则跑不出“恩五叶蜜”绞股蓝过氧化氢同功酶谱。
       3.3  随着对绞股蓝研究的深入，其在医药工业、饮食工业、化妆品工业、香烟工业用途广泛，用量大能形成多个大的新的经济增长点，绞股蓝16种2变种，一个种又有多个品种，目前仅绞股蓝原种及其品种被开发利用，但绞股蓝同功酶谱的研究目前还处于初始阶段，有待进一步深入研究。
       　　参考文献：
       ［1］  郑小江.“恩五叶蜜”、“恩七叶甜”及绞股蓝原变种的化学成分分析［J］.湖北民族学院学报，2002,20（3）：66.
       ［2］  周传明.几种相思树的过氧化物酶同功酶的初步研究［J］.广西热带农业，2003，1：4.
       ［3］  吴显荣.基础生物化学［M］.北京：中国农业出版社，1995：98.
       (湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施  445000；华中农业大学植物科学技术学院，湖北 武汉  430070)