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       【摘要】 
       目的比较糖尿病性心肌病大鼠和中药复方糖心康治疗组大鼠心肌组织中基因表达的差异，并用Eve green实时荧光RT-PCR技术定量检测溶质载体家族4阴离子交换体成员（Slc4a1mRNA）在各组大鼠心肌组织的表达水平。方法差异表达基因的筛选；荧光定量RT-PCR的检测。结果糖尿病性心肌病模型组心肌组织基因Slc4a1mRNA表达下调，中药复方糖心康治疗组心肌组织基因Slc4a1mRNA表达上调。结论Slc4a1mRNA在糖尿病状态下心肌组织也有表达，并且表达下调，而中药复方糖心康可使其上调，这也是中药复方糖心康对糖尿病性心肌组织损伤具有保护作用的机制之一。
       【关键词】  糖心康 糖尿病 心肌损伤 溶质
       载体家族4阴离子交换体成员糖尿病心肌损伤系糖尿病（DM）常见慢性并发症之一，其病变可以是原发的，也可继发于冠状动脉供血障碍，且心肌病变出现较早，主要表现为心肌舒张和收缩功能障碍，易发生充血性心力衰竭。其确切的病理机制尚未彻底阐明，临床尚无特效药物，而中医药在防治该病方面很有潜力，但因其病理机制复杂，其状态的描述和中药复方多成分、多环节、多靶点的作用机制，又是传统单因素研究理论与方法难以解决的，为此借助分子生物学研究方法，采用基因芯片技术，利用目前国际学术界公认的Affymetrix 公司生产的Rat 2302.0 基因芯片，寻找糖尿病心肌病相关基因，探讨糖尿病心肌病分子生物学机制, 阐释中药复方糖心康治疗糖尿病心肌病的作用机理，对STZ诱导DM大鼠的心脏基因表达谱进行了研究，并对筛选出的差异表达基因用Eve green实时荧光RT-PCR技术检测其在大鼠心脏组织中的含量及表达水平。本文仅报告糖心康对糖尿病心肌病大鼠心肌组织基因Slc4a1 mRNA表达的影响。
       1  材料
        1.1  试剂和药品链脲佐菌素（STZ，CALBIOCHEM，USA）；糖心康为黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制作；Rat 2302.0 基因芯片（AFFYMETRIX，USA）。
        1.2  动物造模及分组Wistar大鼠，雄性，体重200～230 g，除空白对照组外，余者以25 mg·kg-1 STZ左下腹腔注射，造模成功后，再随机分为模型组和治疗组。各组均喂以高热量饲料。
       2  方法与结果
        2.1  给药方法治疗组以中药糖心康灌胃，空白组及模型组以生理盐水灌胃。
        2.2  标本采集快速用180 ℃、12 h处理过的手术剪刀摘取心脏，立即用预冷的生理盐水冲洗，冲洗后在冰上操作，沿心室长轴切取心肌，置于液氮中冻存，以备提取RNA使用。
        2.3  心肌组织差异表达基因的筛选
        2.3.1  总RNA提取从各组大鼠中取心脏, 使用QIAGEN"s RNAeasy Total RNA Isolation Kit抽提总RNA，由纯化的总RNA合成双链cDNA，经PLG提取、乙醇沉淀将双链cDNA纯化，用BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit方法以生物素标记cRNA合成，QIAGEN Rneasy Columns法体外转录纯化生物素标记的cRNA，用分光光度计分析RNA浓度进行质控，凝胶电泳检测IVT产物，片断化cRNA，合成cRNA 探针。
        2.3.2  基因芯片的杂交、洗脱、染色及检测合成好的cRNA探针经片段化处理后用于与基因芯片杂交。基因芯片为Affymetrix　Rat 2302.0基因表达谱芯片，芯片的杂交、洗脱、染色及检测利用Affymetrix公司生产的专用设备“基因芯片检测工作站”（work station）进行，操作过程均按该公司推荐的条件进行。
        2.3.3  基因芯片检测数据的处理芯片扫描数据应用“Affymetrix Microarray Suite software 5.0”进行数据处理。
        2.3.4  结果筛选标准说明：差异基因筛选标准为change为I或MI，ratio>或＝1，实验组Detection为P的为上调基因，change为D或MD，ratio<或＝-1，对照组Detection为P的为下调基因。 
        散点图X轴为对照组信号值，Y轴为实验组信号值，图中红色点为实验组和对照组该基因的Detection均为P，蓝色为两组中有一个值不是P，而黄色点为两组均为A（图1～4）。
        按照比较严格的条件筛选出差异表达基因，表达差异2倍以上的基因列表，包括基因名称、GenBank号、Uni号和染色体定位。其中，BE113640: solute carrier family 4, anion exchanger, member 1，溶质载体家族4阴离子交换体成员1（又称带3蛋白），在糖尿病大鼠心肌组织表达下调，糖心康治疗组表达上调。
        2.4  荧光定量RT-PCR检测心肌组织Slc4a1mRNA的表达采用Eve green法，sense primer: 5/ AGGCAATGCACGTCGTCTTTCC-3′，length: 22 bp， Tm值: 60.5 ℃；anti-sense primer: 5′- GATACAGGTGAGCGACTGAGGC-3′，length: 22 bp, Tm值: 60.2 ℃；product length: 156 bp，product Tm值: 84.9 ℃。
        2.4.1  RNA样品反转录使用TAKARA 公司的RNA PCR kit反转录试剂盒，按照试剂盒提供的反应体系进行反转录反应。反转录体系10 μl，30 ℃反应10 min，42 ℃反应30～50 min，95 ℃加热5 min，4 ℃反应5 min中止。
        2.4.2  结果模型组大鼠心肌组织中Slc4a1mRNA表达下调，与空白组比较差异显著（P＜0.01），而经糖心康治疗后大鼠心肌组织中Slc4a1mRNA表达上调，与模型组比较有显著差异（P＜0.01）。见表1。表1  各组Slc4a1mRNA的表达水平比较
       3  讨论
        本研究以《金匮要略》治疗消渴病理法及相关论述为指导，并结合临床经验，根据该病气阴两虚、血瘀错综复杂的病变性质，主张随病证宜多法联用，从而确定了益气养阴活血为该病的主要治法，研制中药复方糖心康，由太子参、黄芪、麦冬、玉竹、枸杞、丹参、土鳖虫等药组成。诸药相合，补而不滞腻，通而不伤正，滋而不助湿，温而不伤阴，共奏益气养阴、通络化瘀之效。
        溶质载体家族4阴离子交换体成员1与糖尿病的发生发展有着十分密切的关系，尤其是Slc4a1mRNA在调节能量代谢在糖尿病的发生、发展中起着重要作用。近年来对Slc4a1mRNA在呼吸衰竭、贫血中的作用机制研究比较多，而中药复方对糖尿病状态下Slc4a1mRNA调控研究未见专门报道。
        BE113640: solute carrier family 4, anion exchanger, member 1，溶质载体家族4阴离子交换体成员1（Slc4a1），又称带3蛋白，是一种红细胞嵌膜蛋白，占总蛋白的25%～35％，含有911个氨基酸，分子量约为95kD，在红细胞、淋巴细胞、肾、肝、脑和心等组织细胞中均有表达［1］，其基因家族成员所表达的C端（55kD）为跨膜区，结构呈高度相似，主要生理功能是转运阴离子HCO3-，Cl-，SO42-，HPO42-等，其中最重要的是介导HCO3-/Cl-交换，排HCO3－使细胞酸化，胞内的氨基酸、多元醇、甲胺类等都是通过具有阴离子通道特性的蛋白介导转移到胞外的。而N端（40kD）为胞浆区，其氨基酸序列差异很大，有锚蛋白、带4.1蛋白、带4.2蛋白、糖酵解酶类、过氧化氢酶和血红蛋白的结合位点。带3蛋白以同2，3－二磷酸甘油酸（2，3－DPG）相似的方式结合血红蛋白。2，3－DPG是红细胞无氧糖酵解的中间产物，对Hb的亲和力比对HbO2的亲和力要大的多，能够降低血红蛋白对氧气的亲和力，使细胞向组织释放更多的氧。而带3蛋白反向转运HCO3-/CL-的功能，能够使血红蛋白完成运载CO2的任务，保持血液pH正常。
        本实验前期结果亦显示，糖尿病状态下葡萄糖与Hb结合形成糖化血红蛋白，使血糖向组织供氧能力下降［2］，氧化磷酸化障碍，ATP生成减少。带3蛋白胞浆区（cytoplasmic domain of band 3 protein，CDB3）N端也是糖酵解酶的结合域。生理状态下，带3蛋白不仅调节糖酵解过程，产生大量的ATP以满足机体能量代谢的需要，而且可以保护酵解酶活性，免受胞浆蛋白酶降解。而在糖尿病性心肌损伤状态下，大鼠心肌带3蛋白含量明显减少，酵解酶失去保护而降解，不能促进糖酵解的进行，使心肌能量生成不足，ATP不足可引起Ca2＋超载，使心肌收缩性减弱，反映在心脏功能上为需要消耗大量ATP的舒张期顺应性下降。同时心肌细胞内的钙离子过负荷，可导致左室压和舒张末期压升高，加重糖尿病性心肌病大鼠心肌损伤。
        本实验结果表明，糖尿病性心肌病时Slc4a1mRNA呈低表达，而应用中药糖心康后，Slc4a1mRNA表达上调，说明糖心康对Slc4a1mRNA的表达具有调节作用，这也是中药复方糖心康对心肌损伤保护作用机制之一。
        
       【参考文献】
         ［1］ Fu GH, DU HQ, Li HT, et al. Expression and Characterization of 55KD transmembrane domain of band 3 any glycophorin A［J］.Progress in Natural science, 2002,12（2）：1.
       
       ［2］ 姜德友，柳成刚，李秀源，等. 肾消康对糖尿病肾病大鼠血清GH/IGF-1轴影响的实验研究［J］.陕西中医.2006,27 （11）：1434.