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       【摘要】 
       目的探讨甘草与附子配伍后甘草黄酮含量的变化。 方法以甘草苷为对照品，用高效液相色谱法测定甘草及其甘草与附子配伍前后煎煮液中甘草苷的含量。结果甘草苷在4.4～44 μg/ml范围内呈良好的线性关系(r=0.999 8)；甘草与附子配伍后合煎比甘草单煎液甘草苷的含量降低。 结论甘草与附子配伍，使甘草苷等黄酮类成分的含量降低，为中医配伍提供了物质基础上的依据。
       【关键词】  甘草苷 含量测定 附子 配伍
       
       Determination of Liquirtin in Licorice by HPLC and its Change before and after Compatibity of Licorice with Aconite
        SHEN Shaohua1, ZHANG Yuyan1,YANG Jiehong2*，SUN Guojin1
        （1. Bioengineering College of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053, China； 2.Basic Medicine College of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou，310053，China）
        Abstract：ObjectiveTo observe the changes of liquirtin content before and after compatibility of Licorice with Aconite. MethodsTaking Liquirtin as reference substance,the content of Liquirtin extracted  from  Licorice with water，and extracted from admixture of Licorice with Aconite was detected by high performance liquid chromatography（HPLC).ResultsThe linear range was obtained between 4.4～44 μg/ml（r=0.999 8）.The content of Liquirtin decocted from admixture of Licorice with Aconite was less than that from Licorice individually.ConclusionThe compatibility of Licorice with Aconite reduces the toxicity of Aconite through components"  harmony，and the changes of flavonoid content such as Liquirtin is one of material bases.
        Key words：Liquirtin；  Contents determination；  Aconite；  Compatibility
        甘草是豆科植物甘草Glycyrrhiza  uralensis Fisch.胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎［1］。具有补脾益气、清热解毒、 祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效。其主要化学成分有三萜类、黄酮类（甘草黄酮、异甘草黄酮、甘草素、异甘草素等）、生物碱类及多糖类。现代研究表明，甘草黄酮具有明显的抗肿瘤［2］、抗氧化作用，对溃疡［3］、肝损害、病原微生物、酶及抗炎和抗变态反应作用等方面都有明显的药理作用。　
        临床附子常与甘草配伍，甘草能降低附子毒性，还可以促进附子的强心作用，其中甘草酸、甘草黄酮与附子生物碱之间起着十分关键的作用，以往侧重于研究甘草酸和附子生物碱的变化，而甘草黄酮能拮抗乌头碱引发的心律失常，也为降毒的主要有效成分，可能在甘草与附子配伍过程发挥作用，为附子与甘草配伍能减毒增效的重要物质基础。本实验针对甘草黄酮在配伍中关键作用，以甘草苷为代表从药物分析学角度进行配伍研究，用高效液相色谱法测定甘草中甘草苷的含量，比较甘草单煎、甘草与附子配伍合煎对甘草黄酮（甘草苷）溶出的影响，研究附子与甘草配伍减毒增效的物质基础，以期为中医配伍理论提供可靠的实验依据。
       1  仪器与材料
        1.1  仪器  日本岛津高效液相色谱仪：LC-10ADVP系列，VP-ODS C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），LC-10ADVP高压泵，CTO-10AVP柱温箱,SPD-10AVP紫外检测器；TU-1900双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；AG135电子天平（瑞士，梅特勒-托利多仪器有限公司）；Simplicity超纯水仪（美国Millipore corporation）；USC-202超声波清洗器（上海波龙电子设备有限公司）；DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）。
        1.2  药品与试剂  甘草苷标准品（111610-200604，中国药品生物制品检定所，购自浙江省药品检验所）；甘草、附子（购自浙江省临安市医药药材有限公司）；乙腈（色谱纯,韩国Korea,SK chemicals）；无水乙醇、醋酸等均为分析纯；水为超纯水。
       2  方法与结果
        2.1  色谱分析条件［1］流动相为乙腈-0.5%醋酸(15∶85)，流速为1.0 ml/min，紫外检测波长276 nm，柱温30℃，进样体积为20 μl，理论塔板数按甘草苷计不低于3 000。在该色谱条件下,对照品及样品的色谱图见图1～3。
        2.2  对照品溶液的制备   取甘草苷标准品2.2 mg，加甲醇溶解,并用甲醇定容至50 ml，作为浓度44 μg/ml的对照品溶液。
        2.3  供试品溶液的制备  取甘草5 g，甘草5 g和附子5 g，加水100 ml，浸渍30 min，煎煮1 h，过滤，药渣加水50 ml，过滤，合并滤液，低温浓缩定容至100 ml。取定容液10 ml，加无水乙醇至25 ml，冷藏24 h，过滤，滤液浓缩定容至25 ml，定容液过0.45 um微孔滤膜，取0.8 ml，加流动相至5 ml，作为甘草单煎液、甘草与附子合煎液。
        2.4  标准曲线的绘制  分别取对照品溶液0.5，1，2，3，4，5 ml，用流动相定容至5 ml，按上述色谱条件，分别进样20 μl，测定其峰面积，并以峰面积为纵坐标，对照品浓度（μg/ml）为横坐标作图，得回归方程为Y=34 929X+11 574(r=0.999 8)。结果表明，甘草苷在4.4～44 μg/ml呈良好的线性关系。
        2.5  精密度实验取对照品溶液(17.6 μg/ml)，重复进样6次，20 μl/次，测定峰面积，结果RSD为1.08%。说明仪器精密度良好。
        2.6  稳定性实验 取对照品溶液(17.6μg/ml)、甘草单煎液、甘草与附子合煎液分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h进样20 μl，测定峰面积,结果RSD分别为1.95％，1.18％，1.99％，对照品溶液及各样品溶液在24 h内基本稳定。        
        2.7  重复性实验  按照“2.3”项下制备方法制备甘草单煎液、甘草与附子合煎样品液各5份,按选定的色谱条件测定峰面积,计算甘草苷含量，结果RSD分别为2.91％，2.40％。
        2.8  回收率实验  精密吸取已测知含量的供试品溶液，加入高、中、低3种浓度的对照品溶液，用流动相定容，摇匀，按选定的色谱条件测定，同行各测定3次，并计算回收率，甘草单煎液、甘草与附子合煎液平均回收率分别为98.25％，97.64％，RSD分别为0.99％，0.86％。
        2.9  样品测定  按照“2.3”项下制备方法制备甘草单煎液、甘草与附子合煎样品液各3份，按选定的色谱条件 测定峰面积，计算甘草苷含量。结果甘草与附子配伍后，甘草苷的含量明显减少，见表1。表1  甘草苷含量测定结果%
        样品甘草苷含量123平均值甘草单煎液0.760.750.770.76甘草与附子合煎液 0.480.480.470.48
       3  讨论
        甘草苷是甘草黄酮的有效成分之一。目前测定甘草苷的方法有比色法［4］、高效液相色谱法［5～7］。比色法操作繁琐费时，且准确度不高，后一种也有不尽完善的地方。
        本实验采用高效液相色谱法，发现甘草苷周围有一个干扰峰，比较了乙腈-醋酸-水的不同比例洗脱，结果乙腈-0.5%醋酸(15∶85)为流动相时的分离效果最好,能很好地分离各样品液中的甘草苷。《中国药典》（2005版）及文献［8～10］中报道的流动相即乙腈-0.5%醋酸(1∶4)，测定甘草药材中的甘草苷,能很好地分离,但测定甘草附子配伍煎液中的甘草苷,分离不理想。此外,从酸度对色谱柱的影响及经济、环保等方面考虑,采用流动相为乙腈-0.5%醋酸(15∶85)较好。实验结果甘草苷在4.4～44 μg/ml范围内呈良好的线性关系(r=0.999 8)。本方法操作简便，方法灵敏，可靠，重复性好。
        由表1可知，甘草与附子配伍后，能明显减少甘草黄酮（甘草苷）的含量。由实验可知，甘草与附子配伍，甘草能抑制附子的毒性，甘草黄酮（甘草苷）可能是其中一种主要的物质基础。
        甘草苷属二氢黄酮类成分，含有7-羟基, 而苷元甘草素含有7，4’-二羟基，均显酸性, 易与附子中的生物碱(包括酯型生物碱) 发生沉淀反应。杨明等［11］分析了附子与甘草合煎后生成的沉淀, 发现在生成的沉淀中除有酯型生物碱成分、甘草皂苷类成分, 还有甘草黄酮类成分。黄酮类成分与酯型生物碱生成沉淀, 从而可降低药液中酯型生物碱含量, 起到降低附子毒性的作用。本实验发现甘草与附子配伍后其甘草苷含量降低了，可能是甘草苷与附子中生物碱发生了沉淀反应所致，也进一步证实了中医临床配伍的重要性和合理性。
        
       【参考文献】
         ［1］ 国家药典委员会. 中国药典［S］.北京：化学工业出版社，2005：59.
       
       ［2］ 姜 薇，尚 明，马爱英，等.甘草黄酮对S180、H22荷瘤小鼠红细胞膜和肿瘤细胞膜Na+，K+－ATPase及Ca2+，Mg2＋－ATPase活性的影响［J］.中华临床医学杂志，2005，6（5）：1.
       
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       ［5］ 闫永红，王文全，杨 娜. HPLC测定栽培甘草中甘草苷的含量［J］.中国中药杂志，2006，31（11）：926.
       
       ［6］ 崔淑芬，张信青，许柏球，等. 高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸和甘草苷的含量［J］.时珍国医国药，2006，17（3）：307.
       
       ［7］ 赵晓莉，崔小兵，吴 皓，等. HPLC双波长法测定复方甘草合剂中甘草苷、甘草素及异甘草素的含量［J］.中成药，2002，24(3)：175.
       
       ［8］ 伍蔚萍，阎宏涛，孙文基.HPLC法测定甘草中甘草苷的含量［J］.药物分析杂志，2004，24(4)：425.
       
       ［9］ 何三民，石森林.HPLC法测定甘草中甘草素、异甘草素、甘草苷的含量［J］.中草药，2003，7(7)∶618.
       
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       ［11］ 杨 明，刘小彬，黄庆德，等. 附子甘草配伍减毒增效机理探析［J］.时珍国医国药，2003，14（4）：197.