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       【摘要】 
       目的通过药代动力学组织分布研究法，研究牛膝在正常大鼠体内对三妙丸中主要有效成分小檗碱组织分布的影响，以探讨其引药的作用。方法大鼠均分成两组，分别灌胃给予含或不含牛膝的三妙丸水提物，给药后2 h，4 h，6 h和7 d处死动物，取血浆和心脏、后肢关节组织的匀浆，用高效液相色谱（HPLC）法测定组织中小檗碱的浓度。结果含牛膝三妙丸组动物给药后关节药物浓度在2 h时与去牛膝三妙丸组相近，4 h明显高于去牛膝组，6 h与去牛膝组相近，多次给药后明显高于去牛膝组。含牛膝组的关节/心脏药物浓度比始终明显大于去牛膝组。结论牛膝有促进三妙丸中有效成分小檗碱向关节组织分布的作用。
       【关键词】  牛膝 三妙丸 小檗碱 组织分布
       Study on the Drug-guide Effect of Achyranthes bidentata Bl. in Sanmiao Pills in Rats
        SUN Bei, L Ling, LU Zhongxiang, YANG Shiyou
        (Anhui Institute of Materia Medica,  Anhui TCM Research and Development Key Laboratory, Hefei 230022 , China)
        Abstract：ObjectiveTo study the effect of Achyranthes bidentata Bl. in Sanmiao pills on Berberine"s tissue distribution in normal rats. MethodsThe rats were divided into two groups given the water extract of Sanmiao pill with or without Achyranthes bidentata Bl. respectively. 2, 4, 6 hours and 7 days later the animals were killed and the tissue homopenate of heart, arthrosis and blood was prepared, and the berberine concentration was detected by HPLC. ResultsThe arthrosis concentration was the same in the rats with and without  Achyranthes bidentata Bl. in 2 and 6 hours, and obviously higher in 4 hours and 7 days with Achyranthes bidentata Bl. The concentration ratio of arthrosis and heart was significantly higher in rats with Achyranthes bidentata Bl. at all time.ConclusionAchyranthes bidentata Bl. has enhancing effect on berberine"s arthrosis distribution.
        Key words：Achyranthes bidentata Bl.;   Sanmiao pills;   Berberine;   Tissue distribution
        三妙丸是从古代的二妙散演变而来的，方中苍术燥湿健脾，黄柏清热燥湿，牛膝引药下行，故治湿热下注等症。中医典籍中记载，牛膝除了具有化瘀通络、补肝强肾功效外，还有“引药下行”的作用，因此多用于治疗下肢疾患。如《寒温条辨》记载：“牛膝,生用其性下走如奔,破血症,通经闭,引诸药下行。”《本经逢原》亦云：“丹溪言牛膝能引诸药下行,筋骨痛风在下者宜之。”
        牛膝“引药下行”的作用虽然被诸多医书所记载，但其作用机理尚不明确，有研究认为其“引药下行”作用可能是与苍术、黄柏的药效协同作用［1］，但是否与现代医学中认为的促进有效成分向病灶部位分布有关尚待研究。本文采用药物组织分布的研究方法，观察牛膝对三妙丸中有效成分小檗碱在大鼠口服后组织分布的影响，以探索牛膝在三妙丸中“引药”的作用机理。
       1  材料与仪器
        1.1  药材 黄柏Phellodendron chinense Schneid.产地四川，牛膝Achyranthes bidentata Bl. 产地河南，苍术Atractylodes lancea (Thunb)DC.产地安徽，均购自本地药房。符合《中国药典》（2005版）Ⅰ部标准。
        1.2  化学对照品 盐酸小檗碱对照品（批号110713-200609），购于中国药品生物制品检定所。
        1.3  试剂 乙腈色谱级，美国TEDIA公司生产；磷酸二氢钾、三乙胺均为分析纯。
        1.4  仪器 岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪，配SPD-10Avp紫外－可见检测器。电动玻璃组织匀浆机，宁波新芝生物科技有限公司提供。
        1.5  动物 SD大鼠，体重180～240 g，雌雄各半，由安徽省医科大学动物中心提供，实验前和实验过程中正常饲养和饮水，并观察健康状况。
       2  方法与结果
        2.1  样品处理方法 
        2.1.1  血浆样品处理方法  按照参考文献［2，3］方法，并经过预试，确定以下血样处理方法：抗凝血离心后吸取血浆0.5 ml，加入乙腈4 ml，涡旋混匀 3 min，3 000 r·min-1离心10 min，取尽上清液40℃氮气吹干，精密加入流动相1 ml使溶解，进样20 μl（采用进样阀），进行HPLC测定。
        2.1.2  心脏组织样品处理方法    取心脏剪开后用生理盐水冲洗干净，用手术剪刀剪碎，取1 g加蒸馏水2 ml，于匀浆机上匀浆，匀浆液离心后取上清液1 ml，加入乙腈4 ml，涡旋混匀 3 min，3 000 r·min-1离心10 min，取尽上清液40℃氮气吹干，精密加入流动相1 ml使溶解，进样20 μl，进行HPLC测定。
        2.1.3  关节组织样品处理方法    从大鼠髁关节上1 cm处剪下大鼠整个后足，剥去皮肤，生理盐水冲洗干净，用剪刀剪取从髁关节上1 cm到下1 cm的全部关节，并剪碎，称取1 g，置于匀浆管中，加蒸馏水2 ml，于匀浆机上匀浆，匀浆液离心后取上清液1 ml，加入乙腈4 ml，涡旋混匀 3 min，3 000 r·min-1离心10  min，取尽上清液40℃氮气吹干，精密加入流动相1 ml使溶解，进样20 μl，进行HPLC测定。
        2.2  小檗碱测定方法的考察
        2.2.1  色谱条件ODS C18色谱柱（250  mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈∶0.05 M磷酸二氢钾溶液（加入0.4％三乙胺，用磷酸调节pH值到2.5）＝27∶73，流速1ml·min-1,检测波长为345 nm。
        2.2.2  特异性  分别对空白血清样品、空白心脏样品、空白关节样品、小檗碱对照品，实测样品进行处理和进样，血样处理方法同上。记录色谱图，见图1～7。
        2.2.3  标准曲线和灵敏度准确吸取小檗碱对照品溶液一定量，加入0.5 ml空白血浆，制成含小檗碱浓度为0.02，0.08，0.2，0.4，1.0 mg·L-1的标准溶液，同样品处理方法操作，进行HPLC测定。将测得的峰面积对浓度作回归曲线，所得的标准曲线为：A = 2 593.5C+24.8 （0.02～1.0 mg·L-1，n＝5，r＝0.999 8），最低检测限为0.2 ng。
        图7  关节样品HPLC图
        准确吸取小檗碱对照品溶液一定量，加入1 ml空白心脏组织匀浆上清液中，制成含小檗碱浓度为0.01，0.1，0.2，0.35，0.5 mg·L-1的标准溶液，同样品处理方法操作，进行HPLC测定。将测得的峰面积对浓度作回归曲线，所得的标准曲线为：A =5.321C +43.4 （0.01～0.5 mg·L-1，n＝5，r＝0.999 0），最低检测限为0.2 ng。
        准确吸取小檗碱对照品溶液一定量，加入1 ml空白关节组织匀浆上清液中，制成含小檗碱浓度为0.01，0.04，0.1，0.2，0.35，0.5 mg·L-1的标准溶液，同样品处理方法操作，进行HPLC测定。将测得的峰面积对浓度作回归曲线，所得的标准曲线为：A = 4 992.8C +41.8（0.01～0.5 mg·L-1，n＝5，r=0.999 3），最低检测限为0.16 ng。
        2.2.4  回收率和精密度测定  以血液0.02 mg·L-1，心脏和关节组织0.04 mg·L-1 两种浓度考察测定回收率和精密度（日内、日间）。结果回收率和精密度均符合要求。
        2.3  大鼠给药和组织分布的研究  大鼠随机分成两组，一组灌胃给予三妙丸的水提液，剂量为18 g生药（苍术∶黄柏∶牛膝＝3∶2∶4）·kg-1，另一组灌胃给予不含牛膝的三妙丸水提液，剂量为10 g生药（苍术∶黄柏＝3∶2）·kg-1。给药后2，4，6 h每组分别处死大鼠6只，取血、心脏和关节进行测定。动物继续给药，1次/d，共7 d，于第7天给药后6 h每组分别处死大鼠6只，取血、心脏和关节进行测定。结果见表1～2。表1  单次给药2 h后小檗碱的组织分布与不含牛膝三妙丸组比较，*P<0.05；**P<0.01；#为关节浓度与心脏或血浆浓度的比值；n＝6
        从表1结果看，含牛膝组动物血液和心脏的药物分布明显减少，关节分布与未含牛膝组一致。关节/心脏比和关节/血浆比均明显高于不含牛膝组。表2  单次给药4 h及6 h后小檗碱的组织分布同一时间点的不含牛膝三妙丸组比较，*P<0.05；**P<0.01；#为关节浓度与心脏或血浆浓度的比值；n＝6
        从表2结果看，给药4 h后含牛膝组关节组织浓度明显升高，且远高于不含牛膝组，关节/心脏药物浓度比明显大于不含牛膝组。给药6 h后含牛膝三妙丸组组织浓度下降，低于不含牛膝组，但关节/心脏药物浓度比仍高于不含牛膝组。
        从表3结果来看，含牛膝的三妙丸组大鼠给药后关节组织小檗碱蓄积浓度高于去牛膝三妙丸组，关节/心脏药物浓度比值含牛膝三妙丸组明显高于不含牛膝的三妙丸组。表3  多次给药后小檗碱的组织分布与不含牛膝三妙丸组比较，*P<0.05,**P<0.01；#为关节浓度与心脏或血浆浓度的比值；n＝6
       3  讨论
        郭顺根等［4］研究表明，中药的归经与有效成分的作用靶器官分布有着一定的联系。因此通过探讨作用靶器官有效成分的分布可在一定程度上验证中药的引经归经理论。
        本实验选择心脏作为药物的非作用靶器官进行参照，后肢足关节为药物作用的靶器官，血液为贯穿全身的组织。三妙丸中的小檗碱具有抗炎消肿的作用，是三妙丸中的有效成分之一，以其作为研究对象具有检测可靠性强，作用代表性明确的优点。
        文献研究［5］表明，大鼠静脉注射小檗碱后，药物迅速分布到组织，其中分布最高的为心，其次为肾、肺和肠。血液中的药物浓度仅为心脏中的1/23。这与本文中后期血药浓度低到不可测，而心和关节的浓度仍可测得相一致。
        从给药后的情况来看，含牛膝三妙丸组2 h时心脏和血液小檗碱分布少，但关节分布与去牛膝组的相当；4 h时去牛膝三妙丸组心脏和关节小檗碱浓度开始明显下降，而含牛膝三妙丸组心脏和关节中小檗碱浓度均明显增加，且显著大于去牛膝组；6 h后含牛膝组和不含牛膝三妙丸组小檗碱浓度均下降。从单次给药后各时间点的关节/心脏小檗碱浓度比数据来看，含牛膝组小檗碱在关节中的分布比例始终高于不含牛膝组，表明了牛膝有将药物引向关节的趋势。多次给药后小檗碱的组织分布趋于平衡，含牛膝组的关节组织分布浓度明显高于去牛膝组，而关节/心脏比值较单次给药时降低。
        从以上结果可初步推断牛膝在三妙丸中的引药作用与促进有效成分向靶器官—足关节的分布有关。本研究尝试性地采用药代动力学研究方法研究牛膝的引药理论，为中药的引经研究提供新思路，也为开发中药引导药物做些基础工作。
        
       【参考文献】
         ［1］ 尹 莲，徐 立，时 乐，等 加味四妙丸有效部位群的筛选研究［J］.世界科学技术－中医药现代化，2005，7（4）：28.
       
       ［2］ 赵玉男，邢东明，丁 怡，等 解热药YL2000中小檗碱在正常和发热大鼠体内的药物动力学比较［J］.中国药理学通报，2003，19 (10)：1170.
       
       ［3］ 吴艳萍，谭晓梅，邢学峰，等.葛根芩连煎剂中小檗碱在犬体内药动学研究［J］.中国药房，2006，17(11)：811.
       
       ［4］ 郭顺根，赵丽云. 3H - 柴胡皂苷在动物体内分布的整体放射自显影及图像分析的动态定量研究［J］. China Medical Abstract Internal Medicine ,1996，suppl：13.
       
       ［5］ 瞿勤妹，张明发. 小檗碱的药动学［J］.中国医学生物技术应用杂志，2002，2(4)：31.