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       【摘要】 
       目的观察黄芩茎叶总黄酮对大鼠双侧海马注射Aβ25－35引起的学习记忆及神经元形态的影响。方法将30只雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型组、总黄酮组。空白对照组灌胃蒸馏水，1次/d，共7 d，第8天，海马注射生理盐水，继续灌胃；模型组第8天海马注射Aβ25－35 5 μl含10 μg，其它同对照组；给药组50 mg/kg总黄酮每天灌胃1次，共7 d，第8天海马注射Aβ25-35，继续灌胃，各组于第15天采用Morris水迷宫实验观察大鼠学习记忆能力，1次/d，测5 d，处死，Nissl染色观察海马锥体细胞的变化。结果模型组大鼠逃避潜伏期较对照组明显延长，海马CA1区锥体细胞带脱失，不完整，细胞出现空泡样变性，给药组大鼠逃避潜伏期较模型组缩短，细胞损伤较轻。结论黄芩茎叶总黄酮对海马注射Aβ25－35引起的学习记忆损伤及海马神经元形态变化具有保护作用。
       【关键词】  阿尔茨海默病 淀粉样蛋白 黄芩茎叶总黄酮
       
       The Effect of Total Flavonoid of Scutellarea Baicalensis Stem-leaf against Learning and Memory Deficit  Induced by Aβ25－35 Injection in Rat Hippocampus
        YE Hong, WANG Ruiting, ZUO Yanzhen, GUAN Lihua, SHEN Xingbin
        (Chengde Medical College, Chengde 067000, China)
        Abstract:ObjectiveTo investigate the protection of SSTF on memory deficit, neuronal degeneration  induced by bilateral injection Aβ25－35 in rat hippocampus.Methods30 male Wistar rats were randomly divided into three groups. The distilled water  was given (ig, 1/d) to the comparision group and the model group, SSF (ig 50mg/kg/d  1/d)was given to SSF group. On the eighth day  saline or Aβ was injected to bilateral hippocampus of the control group or the model and SSF group .  Morris water maze task was used to evaluate the memory on the fifteenth day,once for 5d. Nissl staining was used to investigate the change of hippocampus nerve cells.ResultsThe model group resulted in a significantly increased latency to find the hidden platform . SSF group resulted in a significantly reduced latency as compared with the model group. The pathological changes included neuron loss,nuclear disappearance in the model group. SSF group showed the reduced damage compared with the model group .ConclusionSSF may be beneficial for improving the learning and memory deficit induced by Aβ25-35.
        Key words:Alzheimer"s disease;  Amyloid-beta protein;  Total flavonoid of Scutellarea Baicalensis stem-leaf (SSTF)
        阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease, AD）亦称老年性痴呆症，是一种以进行性认知功能障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，与年龄的增长密切相关。AD的发病机制复杂，目前研究主要集中在氧自由基、炎症因子及中枢神经元凋亡3个方面。黄芩是我国传统的中草药，众多研究集中在其有效成分黄酮类化合物的研究上，研究表明黄芩茎叶总黄酮具有抗炎、抗免疫、保护心肌缺血再灌注损伤、治疗脑缺血等作用［1］。本实验采用大鼠海马内注射淀粉样蛋白（Aβ）致大鼠痴呆模型，采用Morris水迷宫实验观察黄芩茎叶总黄酮（SSTF）对痴呆大鼠学习、记忆的影响。
       1  材料
        1.1  动物雄性Wistar大鼠30只，体质量（280±20）g, 动物证号712123，由河北医科大学实验动物中心提供，标准环境下饲养；自然光线，自由进食水。
        1.2  试剂Aβ25－35由Sigma公司提供，黄芩茎叶总黄酮由承德医学院中药研究所提供，纯度61.88％。
       2  方法
        2.1  分组及处理将Wistar大鼠随机分为3组，每组10只。空白对照组大鼠给予蒸馏水灌胃，1次/d，7 d，第8天双侧海马各注射5 μl的无菌生理盐水，继续灌胃给蒸馏水；模型组第8天双侧海马各注射凝胶态Aβ25－35 5 μl含10 μg, 其它同空白对照组。给药组黄芩茎叶总黄酮50 mg/（kg·d）灌胃，1次/d，7 d，第8天双侧海马各注射凝胶态Aβ25－35 5 μl含10 μg，继续灌胃给药，3组大鼠于第15天进行水迷宫实验，连续测5 d后处死。
        2.2  制作动物模型大鼠灌胃第8天，用4％的水合氯醛腹腔麻醉（1 ml/100 g），固定于脑立体定位仪（江湾1号C型脑立体定向仪），剪去头顶部毛发，于AP -3.5 mm，ML ±2 mm，DV 2.7mm定位海马，用三棱针钻开颅骨，暴露硬脑膜，微量注射器5 min内缓慢注入Aβ（Aβ溶于无菌生理盐水2 g/L,－20℃保存，临用前置于37℃孵育7 d成凝胶态），留针2 min，缓慢撤针，肌注青霉素3 d，1次/d，10万u。
        2.3  Morris水迷宫行为学实验迷宫装置由中国医学科学院药物研究所提供，圆形不锈钢水池，直径120 cm,高60 cm，水池底和筒壁皆为黑色；将水池等分为4个象限；目标象限的中央放置一直径为10 cm，高23.5 cm的圆形隐藏平台，整个实验期间其位置保持不变；水池中水面高于平台1.5 cm，水温（21±1）℃；水池周围安装环形布帘，实验期间迷宫周围参照物不变，迷宫上方安置摄像机，同步记录大鼠运动轨迹。实验前动物自由游泳2 min，如果大鼠找不到平台，将大鼠放在平台20 s, 每天将大鼠从4个象限点面向池壁各测验两次，记录动物寻找并爬上平台所需时间，如果动物在60 s内未找到平台，由实验者将其引至平台，潜伏期记为60 s。第1～2天为训练，后3 d数据作为学习、记忆成绩。
        2.4  取材、固定、切片、染色动物麻醉后，经左心室快速灌注250 ml的生理盐水，然后灌注含4％多聚甲醛的PB液250 ml(先快后慢)进行固定，1 h后取脑，后固定过夜，脱水，石蜡包埋，行冠状切片，片厚5 μm，切片取含海马部位，用硫堇作Nissl染色。
        2.5  统计学处理实验数据以±s，用SSPS12.0软件进行单因素方差分析。
       3  结果
        3.1  Morris水迷宫实验模型组的逃避潜伏期较空白对照组明显延长（P<0.05）, 药物组与模型组相比明显缩短（P<0.05）。表1  各组大鼠在隐藏平台的平均逃避潜伏期与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；n=10
        3.2  海马的Nissl 染色模型组海马CA1区锥体细胞带脱失，不完整，核边聚，部分锥体细胞出现空泡样变性，注射针道附近可见胶质细胞明显增生。空白对照组细胞带完整，排列有序，未见明显的细胞增生，给药组锥体细胞损伤较小，胶质细胞增生不明显。
       4  讨论
        阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease, AD）是一种以进行性记忆力下降和智能衰退为主要临床特征的中枢神经系统变性疾病，其主要的病理特征是脑内细胞外老年斑（SP）和细胞内神经纤维缠结形成(NFT)，老年斑的核心是β淀粉样肽（Aβ）沉积，Aβ沉积是AD发病的中心环节。体内产生的Aβ有两种即Aβ1－40，Aβ1－42，凝聚态的Aβ可构成淀粉样蛋白纤维，体外凝聚态Aβ与AD患者脑中的Aβ有相似的结构，其中25～35位的氨基酸序列的多肽片断是Aβ的生物活性片断。多项研究表明Aβ体内、体外均可引起学习记忆功能减退及细胞形态改变［2～4］。本实验大鼠双侧海马注射Aβ25－35引起大鼠学习记忆功能的减退，Morris实验显示模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长，给药组较模型组的逃避潜伏期明显缩短，Nissl染色显示模型组CA1区锥体细胞带脱失，不完整，部分锥体细胞出现核边聚，出现空泡样变性。结果显示凝聚态Aβ对海马神经元造成了损伤，黄芩茎叶总黄酮对Aβ引起的损伤有一定保护作用。
        Aβ引起锥体细胞损伤，学习、记忆能力减退的机制研究主要集中在氧自由基、炎症因子、神经元凋亡方面。Aβ本身可产生活性氧（ROS），也可通过多种途径诱导ROS产生，使神经细胞胞浆中自由基浓度升高，使脂质过氧化，形成脂质过氧化物，当线粒体和内质网的膜结构氧化损伤后，钙离子进入胞质，线粒体肿胀，影响到细胞色素氧化酶（COX），细胞色素释放，启动caspase凋亡系统，引起神经元凋亡［5］。
        目前临床对AD的治疗没有较好的药物，开发抗AD药物主要集中在通过研究AD发病的分子机制寻找新的靶点及抗氧化中药的开发上。对黄芩的研究集中在其有效成分黄酮类化合物，赵淑敏等研究显示总黄酮预处理能保护心肌抗氧化酶的活性，抵制脂质过氧化反应，减轻自由基对心肌的损害；商亚珍等［6］研究显示总黄酮通过影响AlCl3引起小鼠海马组织MDA、SOD的变化减轻铝中毒小鼠痴呆程度。因此黄芩茎叶总黄酮预处理可能通过减轻Aβ引起的氧自由基的产生等机制而减轻Aβ引起的损伤。黄芩茎叶总黄酮在抗炎、抗心肌缺血、脑缺血等疾病模型中已显示出其保护作用，其在铝中毒、Aβ引起的痴呆中亦显示出保护作用，其作用机制还有待于进一步探讨。
       【参考文献】
         ［1］ 赵淑敏，刘 胜，杨宏光,等.黄芩茎叶总黄酮预处理对缺血再灌注心肌脂质过氧化损伤的保护作用［J］.解剖学杂志，2006，29（4）：450.
       
       ［2］ Zambrano A, Otth C, Mujica L, et al.Interleukin-3 prevents neuronal death induced by amyloid peptide［J］.BMC Neurosci，2007,8:82.
       
       ［3］ Rodrigo Medeiros, Rui D.S. Prediger, Giselle F, et al. Connecting TNF-α signaling pathways to iNOS expression in a mouse model of Alzheimer"s disease: Relevance for the behavioral and synaptic deficits induced by amyloid β protein［J］.The Journal of Neuroscience，2007,27(20):5394.
       
       ［4］ Berson A, Knobloch M, Hanan M, et al. Changes in readthrough acetylcholinesterase expression modulate amyloid-beta pathology［J］. Brain,2008,131(1):109.
       
       ［5］ Kim SY, Moon JH, Lee HG, et al. ATP released from beta-amyloid-stimulated microglia induced reactive oxygen species production in an autocrine fashion［J］.Exp Mol Med，2007,39(6):820.
       
       ［6］ Yazhen Shang, Jianjun Cheng,Jiemin Qi, et al.Scutellaria flavonoid reduced memory dysfunction and neuronal injury caused by permanent global ischemia in rats［J］.Pharmacology Biochemistry and Behavior,2005,82:67.