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       【摘要】 
       目的考察水蛭素气雾给药对大鼠凝血功能及体内血栓形成的影响。方法测定大鼠凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化的部分凝血酶时间(aPTT)，血浆纤维蛋白原(FIB)含量，观察水蛭素气雾给药的抗凝血作用；建立下腔静脉结扎模型和动-静脉旁路结扎模型，测定大鼠静脉及动脉血栓的湿重和干重。结果与正常对照组相比，水蛭素气雾给药中剂量和高剂量组（500 U·kg-1, 1 000 U·kg-1）对PT，TT，aPTT有显著延长作用（P<0.05或P<0.01）；对大鼠静脉血栓、动脉血小板血栓形成均有显著的抑制作用（P<0.05或P<0.01），对FIB无明显影响(P>0.05)。结论 水蛭素气雾给药能够发挥其抗凝血作用。
       【关键词】  水蛭素 气雾给药 动-静脉旁路血栓 静脉血栓
       
       Effects of Hirudin by Aerosol on Blood Coagulation Function and Thrombosis Formation in Rats
        QIN Liang1，YE Chunling2，FENG Juan2，SONG Wendong3*
        (1.Zhaoqing University, Zhaoqing, Guangdong 526061,China; 2.Jinan University,Guangzhou,, Guangdong 510632,China; 3.College of Science, Zhanjiang Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524088, China)
        Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of hirudin by aerosol on blood coagulation function and thrombosis formation in rats. MethodsTo investigate the effects of hirudin aerosol preparation on prothrombin time(PT) , thrombin time(TT), activated partial thromboplastin time(aPTT), and the content of fibrinogen(FIB) in rats. Built up venous thrombosis model and arteriovenous shunt model to analysis the effect of hirudin by aerosol on venous thrombosis in rats. ResultsHigh and middle dosages of hirudin by aerosol could significantly prolong aPTT，TT，PT and decrease the weight of both venous and thrombocytic thrombus in rats(compared with NS, P<0.05 or P<0.01). However, they had no effect on the content of FIB in rats. ConclusionHirudin aerosol preparation can reach an effective blood levels, has obvious effect on blood coagulation function and thrombosis formation in rats.
        Key words：Hirudin；  Aerosol；  Arteriovenous shunt model;    Venous thrombus
        随着人们生活水平的提高，心脑血管疾病已成为现今威胁人类健康的最主要杀手之一。其发病率随年龄的增长而增高，并已有年轻化的趋势。这类疾病与血栓形成密切相关，因而对防治心脑血管血栓形成药物的研发一直受到人们的关注。水蛭素是目前已知的最强有力的凝血酶天然抑制剂，具有良好的抗凝血、抗血栓作用，对多种血栓疾病如静脉血栓、弥散性血管内凝血、脑血栓、血栓性静脉炎及冠状动脉血栓都有很好的预防和治疗效果［1，2］。
        目前的水蛭素制剂仍以注射剂为主，但是反复注射会给患者带来很大的痛苦和不便，难以适应大多数慢性高凝态疾病患者长期抗凝治疗的需要，后来虽然开发出了片剂，也因严重的首过效应未能发挥出应有的效果。因此，寻找一种疗效确切、给药方便的水蛭素新剂型已成为改善水蛭素应用的一个重要方面［3］。本文探讨了水蛭素气雾给药对大鼠凝血功能及体内血栓形成的影响，为其新剂型的开发提供实验依据。
       1  器材与仪器
        1.1  材料
        1.1.1  动物 健康SD大鼠，♂，体重（200±20）g，由广东省实验动物中心提供，合格证为：SCXK(粤)2007-2006。
        1.1.2  药物与试剂 水蛭素溶液，由广东海洋大学理学院应用化学系提供。肝素钠注射液，上海第一生化药业有限公司产品（批号050301）。
        1.1.3   仪器 CA-1500型血凝仪（日本sysmex公司），LS-8A型超声雾化器（山东医学科学设备站），TDL80-2B离心机（上海安亭科学仪器厂），GSO-9160MBE隔水式烘箱（上海博讯实业有限公司）。
       2  方法
        2.1  动物分组与给药方法 将SD大鼠150只随机分为A，B，C 3大组，每大组再随机分为5组，即正常对照组（给予等容量生理盐水），水蛭素气雾给药高、中、低剂量组(分别给予1 000，500，250 U·kg-1)和低分子肝素组(2 000 U·kg-1)，每组10只。每天超声波雾化器气雾给药1次,给药完毕后让大鼠在喷雾箱内停留5 min将药物吸收完全，取出大鼠。连续给药3 d。
        2.2  大鼠凝血四项指标的测定 于第3天给药后1 h取血。大鼠腹腔注3%戊巴比妥钠(45 mg·kg-1)麻醉、固定、暴露分离下腔静脉，取血置于3.2%枸椽酸钠抗凝剂的离心管中（抗凝剂与血的比例为1∶9），每管2 ml。轻轻颠倒混合10次，防止血块形成,立刻以800 r/min离心10 min，分离血浆。用CA-1500型血凝仪对大鼠凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT) 、活化的部分凝血酶时间(aPTT)和血浆纤维蛋白原(FIB)含量进行测定。
        2.3  大鼠静脉血栓的测定 于第3天给药后1 h大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(45 mg·kg-1)麻醉,固定，分离下腔静脉，在下腔静脉左肾静脉分叉下远心端穿线结扎下腔静脉，同时分离左右骼静脉并穿线结扎，使中间静脉长约2 cm，缝合腹部。由于静脉血流阻断，血栓形成。结扎2 h后再次打开腹腔，剪下结扎的那段下腔静脉，纵向剖开并取出血栓置滤纸上，轻轻吸干后精确称湿重，然后置60℃烘箱中烘干24 h精确称干重。
        2.4  大鼠动脉血栓的测定 于第3天给药后1 h大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(45 mg·kg-1)麻醉，仰卧固定，分离气管，分离右颈总动脉和左颈外静脉。剪一根长6 cm的4号手术丝线，称重后放入三段式聚乙烯管中，使接触血液的丝线长5 cm，剩下的l cm从靠近动脉端的接头处露出来，以生理盐水充满整个聚乙烯管。将静脉端插入左颈外静脉后，从动脉端准确地注入生理盐水，然后将动脉端插入右颈总动脉。手术完毕后打开动脉夹，记时，15 min后中断血流，迅速取出丝线称湿重，并置60℃烘箱12 h后称干重。
       3  结果
        3.1  水蛭素气雾给药对大鼠凝血四项指标的影响 见表1。与正常对照组相比，水蛭素气雾给药高、中剂量组可明显延长大鼠PT,TT，aPTT（P<0.01或P<0.05），但对FIB含量无明显影响（P>0.05）。
        3.2  水蛭素气雾给药对静脉血栓形成的影响见表2。与正常对照组相比，水蛭素气雾给药高、中剂量组可明显减轻大鼠形成静脉血栓的重量(P<0.05或P<0.01)。说明水蛭素气雾给药可抑制大鼠静脉血栓的形成。
        3.3  水蛭素气雾给药对动脉血栓形成的影响 见表3。与正常对照组相比，水蛭素气雾给药高、中剂量组可明显减轻大鼠形成血小板血栓的重量(P<0.05或P<0.01)。说明水蛭素气雾给药对血小板的黏附、聚集有抑制作用，能抑制血小板血栓形成。表1  水蛭素气雾给药对大鼠凝血四项指标的影响表2  水蛭素气雾给药对静脉血栓形成的影响表3  水蛭素气雾给药对动脉血栓形成的影响
       4  讨论
        4.1  水蛭素气雾给药对大鼠凝血功能的影响水蛭素为中药中具有活血化淤功效的水蛭主要有效成分，由65个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量约7 KD，能与凝血酶以等摩尔比结合成难解离的非共价复合物，是迄今发现的最强的凝血酶特异性抑制剂［4］。
        凝血酶原时间是测定外源性凝血系统功能最常用的方法。实验结果表明，水蛭素气雾给药可延长大鼠PT，说明其可干扰外源性凝血系统的活性，抑制凝血酶原向凝血酶的转化，从而使纤维蛋白原向纤维蛋白的转变过程受到抑制。活化的部分凝血酶时间用于检测内源性凝血途径的功能［5］。本实验结果表明水蛭素气雾给药可延长大鼠活化部分的凝血酶时间,说明水蛭素也可干扰内源性凝血系统的活性，抑制凝血酶原向凝血酶的转化，从而使纤维蛋白原向纤维蛋白的转变过程受到抑制。本实验发现水蛭素气雾给药可明显延长大鼠凝血酶时间，凝血酶时间的检测主要是观察凝血酶激活纤维蛋白原这一反应是否能顺利进行,纤维蛋白原是否符合凝血的要求。纤维蛋白原的检测，是加入大量凝血酶，同时稀释FIB，其含量与凝块形成的时间有关，根据形成凝块的时间计算出纤维蛋白原的含量，相比凝血酶原时间、活化的部分凝血酶时间、凝血酶时间，涉及的凝血因子较少(处于凝血反应的后半段)，因此很少受影响。
        4.2  水蛭素气雾给药对大鼠体内血栓形成的影响血栓形成是指血液在变流状态下，止血机制过度激活的一种病理性结局。血栓按照发生的部位分为静脉血栓和动脉血栓。静脉血栓主要由于血流缓慢或淤滞、凝血因子聚集而导致血液凝固所引起，凝血酶的激活是主要因素之一。动脉血栓主要由于血小板相互聚集所引起的，血流速度和血液黏度为次要因素血小板的黏附聚集功能与形成的血栓重量有直接影响。
        本实验采用结扎大鼠下腔静脉建立静脉血栓模型，以血栓湿重和干重的变化反映药物的抗血栓作用。结果表明水蛭素气雾给药组可减轻大鼠静脉血栓的湿重和干重，呈剂量依赖关系，随着剂量增大，血栓湿重和干重减轻更加明显，说明水蛭素气雾给药具有抗静脉血栓形成，抑制凝血系统的作用。
        建立大鼠左颈外静脉-右颈总动脉血流旁路模型可形成血小板血栓。当动脉血流中的血小板接触丝线的粗糙面时粘附于上，发生相互聚集而形成血小板血栓。该法能反映整体动脉血流中血小板的粘附聚集功能。实验结果表明，水蛭素气雾给药组可减轻大鼠动脉血栓的湿重和干重呈剂量依赖关系，随着剂量增大，血栓湿重和干重减轻更加明显，说明水蛭素气雾给药对大鼠血小板的黏附、聚集有抑制作用，能抑制血小板血栓形成。
        综上所述，水蛭素气雾给药具有强大的抗凝血作用，能抑制大鼠静脉血栓、动脉血栓形成，此结果与Antman EM［6］报道一致。因此，可以认为水蛭素气雾给药是一种有效的给药方式，能达到有效的血药的浓度，有可能成为一种临床适用的抗血栓新剂型。
       【参考文献】
         ［1］ 高秀华，张聪敏，石玉珍.水蛭素的临床应用［J］.国外医药·合成药、生化药、制剂分册, 2001,22(5)：273.
       
       ［2］ 陈 萍，李卓明，吴任天，等.水蛭素及其重组技术的研究进展［J］.中药新药与临床药理，2006，17(5):390.
       
       ［3］ Yan XY, Zhang XN, Zhang Q. Absorption of recombinant hirudin in rats GI tract［J］.Acta Pharm Sin, 2004, 39（1）：77.
       
       ［4］ 李素燕，从玉文，毛秉智. 抗血栓药物的研究进展［J］.国外医学·药学分册,2006,33(6)：428.
       
       ［5］ 林 粤，王北宁，韩玲霞. 凝血酶原、部分凝血活酶时间和出凝血时间检测及方法评价［J］.华北国防医药，2006，17(3)：199.
       
       ［6］ Antman EM. Hirudin in acute myocardial infarction. Safety report from the thrombolysis and thrombin inhibition in myocardial infarction(TIMI)9A trial［J］.Circulation, 1994，90(4)：1624.