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       【摘要】 
       目的研究大孔吸附树脂富集纯化枫香槲寄生总黄酮的最佳工艺参数。方法以枫香槲寄生总黄酮吸附量为指标，通过正交实验考察确定了该树脂分离纯化总黄酮的工艺条件。结果AB-8型树脂对枫香槲寄生总黄酮有良好的吸附分离性能，其吸附分离工艺条件为：上样浓度为2.55 mg·ml-1，上样液pH为3，吸附流速为3 BV·h-1，洗脱剂为60%乙醇。结论 AB-8型大孔吸附树脂在所确立的工艺条件下，纯化枫香槲寄生总黄酮效果良好，总黄酮纯度可达60%左右。
       【关键词】  枫香槲寄生 总黄酮 大孔吸附树脂
       Study on the Isolation and Purification of Total Flavonoids from Viscum liquiddambaricolum Hayata.with Macroporous Resin
        ZHONG Shishun1 ，XU Xiongwei1， ZENG Degui2， LI Jianxin3
        （1.Guangdong Institute of Materia Medica , Guangzhou, Guangdong 510440, China; 2.Shenzhen Chronic Disease Hospital, Shenzhen, Guangdong 518020, China；3.Guangdong College of Pharmacology, Guangzhou, Guangdong 510006, China）
        Abstract：ObjectiveTo explore the optimal condition for purification of total flavonoids from Viscum liquiddambaricolum Hayata.with macroporous resin. MethodsThe process technology for purification of total flavonoids with macroporous resin was selected by absorption ratio through orthogonal test. ResultsThe AB-8 macroporous resin owned optimum absorption and elution ability. The optimum absorption conditions were the sample concentration 2.55 mg·ml-1, pH 3, the current velocity 3 BV·h-1, the eluant 60% ethanol (5BV). ConclusionThe AB-8 macroporous resin can be used to purify total flavonoids from Viscum liquiddambaricolum, the purity of total flavonoids is about 60%.
        Key words：Viscum liquiddambaricolum Hayata;   Total flavonoids;   Macroporous resin
        枫香槲寄生Viscum liquiddambaricolum Hayata. 系桑寄生科槲寄生属植物，本植物草药名“枫树寄生”，具有祛风除湿、舒筋活络等功效［1］。我们的前期研究发现，从枫香槲寄生中获得的以两个新的色原酮化合物为代表的黄酮类成分具有较明显的增加冠脉流量，减慢心率和增加心肌收缩力的作用，显示了对心血管疾病的显著活性［2］。为此，分离纯化获得高纯度的槲寄生总黄酮是进行槲寄生开发的关键步骤。大孔吸附树脂近年来已广泛应用于天然植物中活性成分，如皂苷、黄酮、生物碱等的提取分离［3］，本实验采用大孔树脂对槲寄生总黄酮进行富集。现将结果报道如下。
       1  仪器与试药
        1.1  仪器 岛津UV-2201型紫外可见光分光光度计；Sartorius BP201型电子天平；DKZ恒温水浴摇床。
        1.2  试药芦丁对照品（中国药品生物制品检定所提供，含量测定用）；枫香槲寄生药材，购自广州清平药材市场并经广东药学院罗集鹏教授鉴定为枫香槲寄生Viscum liquiddambaricolum Hayata. ；大孔树脂（型号分别为AB-8，DA-201，D-101，均为净品级，天津海光化工有限公司）；NaNO2，Al(NO3)3，NaOH等试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
        2.1  含量测定
        2.1.1  标准曲线的制备精密称取经五氧化二磷干燥恒重的芦丁对照品10 mg，用60%乙醇溶解并定容至100 ml，摇匀备用。精密吸取对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml于10 ml容量瓶中，加入60%乙醇至6 ml，加入5% NaNO2 0.3 ml，摇匀，再加入10% Al(NO3)3 0.3 ml，摇匀，放置5 min后加入4%NaOH 3 ml,用60%乙醇定容至刻度，混匀后放置5 min；同法以60%乙醇加随行试剂作空白在510 nm处测定吸光度［4］。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程：A=11.162 C-0.005 6，r=0.999 8(n=6)，线性范围为10～50 μg·ml-1。
        2.1.2  枫香槲寄生药材总黄酮的含量测定精密称取枫香槲寄生粗粉5.0 g，分别加入60%乙醇40 ml，浸泡0.5 h后置水浴中回流提取2次，2 h/次，提取液滤过、合并，60%乙醇定容至100 ml。精密吸取提取液1.0 ml置于10ml刻度试管中，按标准曲线制备项下方法测定吸光度，计算出枫香槲寄生中总黄酮含量为（10.75±0.47）mg·g-1 (n=5)。
        2.2  大孔吸附树脂纯化工艺考察
        2.2.1  大孔吸附树脂的预处理 因采用净品级树脂，采用乙醇湿法装柱，用乙醇流动清洗，不时检查流出液至与水混合（1∶5）不呈白色浑浊为止，然后以大量纯化水洗去乙醇至流出液无醇味。
        2.2.2  上柱液的制备 称取枫香槲寄生粗粉，分别加入8倍量60%乙醇回流提取2次，2 h/次，提取液滤过、合并，水浴蒸干至无醇味，加入适量纯化水溶解定容至一定体积，即得上柱液。
        2.2.3  静态吸附量考察 分别精密称取预处理过的AB-8，DA-201，D-101树脂各1 g（湿重）置于100 ml锥形瓶中，分别加入10 ml槲寄生提取液（含生药量250 mg·ml-1），室温下置摇床中，以50 r/min下振摇24 h，使之充分吸附，取上清液测定其中总黄酮含量，计算各树脂的静态吸附量。结果见表1。
        静态吸附量（mg/g）=(上样液浓度-上清液浓度)×上样液体积树脂质量
        2.2.4  静态解吸量考察 取“2.2.3”项下已充分吸附过的树脂，分别加入60%乙醇30 ml，室温下置摇床中，以50 r/min振摇24 h，使之充分解吸，取上清液测定其中总黄酮含量，计算各树脂的静态解吸量。结果见表1。
        静态解吸量（mg/g）=（洗脱液浓度×洗脱液体积) /树脂质量
        解吸率（%）=静态解吸量/静态吸附量×100%表1  不同类型的大孔吸附树脂对总黄酮吸附及解吸效果综合以上实验，表明3种树脂中AB-8型树脂吸附量最大，而且解吸效果也比较完全，因此选用AB-8树脂对槲寄生提取液中总黄酮进行纯化。
        2.2.5  大孔树脂吸附条件优化 在预实验的基础上，将对AB-8树脂吸附总黄酮影响较大的样品溶液的浓度、上样液pH值、吸附流速3个 因素，每个因素3个水平，按L9（34）表进行正交实验。精密称取AB-8型树脂5 g（湿重），装柱，柱径高比为1∶10，上样量为5.0 g枫香槲寄生药材提取液，按表2的条件分别上样，测定流出液的总黄酮含量并计算对应的树脂的吸附量，实验结果及方差分析分别见表2～3。
        动态吸附量（mg/g)=（上样液浓度-流出液浓度）×上样液体积树脂质量表2  正交实验设计及结果表3  方差分析
        由表3可知，上样浓度、吸附流速对总黄酮的吸附量影响无显著性差异，上样液pH值对吸附量有显著性差异，最后确定最佳吸附条件为A2B1C2，即上样浓度为2.55 mg·ml-1（约合生药量250 mg·ml-1），上样液pH值为3，吸附流速为3 BV·h-1。
        2.2.6  验证实验 精密称取AB-8型树脂5.0 g（湿重），装柱，柱径高比为1∶10，上样量为5.0 g枫香槲寄生药材提取液，按正交实验筛选出的最佳参数上样，计算树脂吸附量。结果见表4。表4  验证实验结果由表4可知，根据最佳条件进行动态吸附，树脂吸附量较大。
        2.2.7  洗脱剂的选择 按“2.2.6”项中已吸附平衡的树脂，用不同浓度的乙醇进行动态洗脱，先用100 ml纯水洗脱，再依次用10%乙醇，30%乙醇，60%乙醇， 95%乙醇各100 ml洗脱，洗脱流速为2 BV·h-1，分段收集洗脱液，每管25 ml，测定其中总黄酮的含量。以流份序号为横坐标，每管总黄酮含量为纵坐标，绘制梯度洗脱曲线。见图1。
        2.2.8  分离的枫香槲寄生总黄酮纯度考察按“2.2.6”项中已吸附平衡的树脂，用60%乙醇100 ml洗脱，洗脱流速为2 BV·h-1，收集洗脱液，定容至100 ml。精密吸取10 ml洗脱液两份，一份依标准曲线测定总黄酮的含量，一份置于已恒重的蒸发皿，水浴蒸干后置于105℃干燥3 h，取出置于干燥器中30 min后精密称重，测定干膏收率，计算总黄酮的纯度。结果见表5。表5  总黄酮纯度测定结果
       3  结论
        AB-8树脂为弱极性，比面积大，槲寄生总黄酮在pH为3的条件下树脂吸附量最大，同时，在60%乙醇中洗脱较完全。虽然枫香槲寄生药材中总黄酮含量较低，但经AB-8树脂富集纯化后样品纯度可达60%以上，可为下一步研究提供物质基础。树脂可以再生利用，成本较低，生产周期较短，所以该工艺也较易推广至大规模生产。
        
       【参考文献】
         ［1］ 中国科学院华南植物研究所. 广东植物志［M］.广州：广东科技出版社，1987：227.
       
       ［2］ 杨燕军. 枫香槲寄生化学成分的研究［J］.中药材，1998，21（1）：22.
       
       ［3］ 刘瑞源，钟 平. 大孔吸附树脂提取中草药有效成分的研究进展［J］.时珍国医国药，2004，15（6）：封3.
       
       ［4］ 魏永生，王永宁，石玉平，等. 分光光度法测定总黄酮含量的实验条件研究［J］.青海大学学报（自然科学版），2003，21（3）：61.