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       【摘要】 
       目的研究中药延胡索中去氢紫堇碱对照品的制备及含量测定方法。方法采用硅胶柱色谱与半制备高效液相色谱组合分离技术，分离纯化去氢紫堇碱，采用薄层色谱法和高效液相色谱面积归一化法检测纯度，波谱法鉴定其结构，反相高效液相色谱法测定其含量。结果制备的化合物鉴定为去氢紫堇碱，纯度为98.7％；含量测定在0.076 3～0.457 6 μg呈良好线性关系，r = 0.999 8，平均回收率为104.44 %，RSD为2.36%（n=6）。结论 该制备方法效率高，所得化合物纯度高，可用于大量制备。含量测定方法准确，简便，可靠，重复性好。
       【关键词】  延胡索 去氢紫堇碱 半制备高效液相色谱法 反相高效液相色谱法
       延胡索Corydalis yanhusuoW. T. Wang.为罂粟科植物延胡索的干燥块茎，具有活血化淤，利气止痛功能，用于各种痛症的治疗［1］。延胡索中主要含生物碱，其中延胡索乙素和丑素是延胡索镇痛的主要活性成分［2］，2005年版《中国药典》及成方制剂中均采用延胡索乙素为对照品进行评价［3～5］。本课题组研究发现，延胡索生物总碱具有较好的抑制乙酰胆碱酯酶的作用，其中去氢紫堇碱是主要活性成分之一。但国内未获得去氢紫堇碱对照品商品，并且也未见采用去氢紫堇碱为对照品来评价延胡索质量的报道。因此，有必要对延胡索中去氢紫堇碱进行定性鉴别和含量测定。现将延胡索中去氢紫堇碱对照品的制备方法和含量测定方法报道如下。
       1  仪器与试剂
        X-4型显微熔点仪（国产，温度计未校正)；INOVA-400型核磁共振仪 (TMS为内标)； HP 5973质谱仪 (电离条件为70 eV)；KQ-250B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；高效薄层层析板(GF254，青岛海洋化工厂生产)；甲醇、乙腈为色谱醇，其他化学试剂均为分析醇，水为纯净水。
        延胡索药材采自浙江省东阳市，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang.的干燥块茎。
       2  方法与结果
        2.1  去氢紫蓳碱粗提物的制备取延胡索粗粉5 kg，用10倍量的70%的乙醇回流提取两次，2 h/次，滤过，滤液减压回收溶剂,得乙醇提取浸膏。乙醇提取浸膏加入10%的盐酸溶液溶解，调pH 2～3，滤过。滤液用石油醚萃取，水部分用浓氨水调pH 9～10，用氯仿萃取,氯仿部分再用水洗，浓缩水洗液至浸膏。将上述所得浸膏上硅胶柱,用氯仿-甲醇-醋酸乙酯梯度洗脱，收集氯仿-甲醇-醋酸乙酯(8∶1∶1)部分，低温减压回收溶剂得去氢紫堇碱粗提物。
        2.2  色谱条件
        2.2.1  制备HPLC色谱条件  XTerra Prep RP-18柱（10 μm ,150 mm × 7.8 mm）；柱温为室温；检测波长345 nm；流动相为0.01 mol·L-1碳酸氢铵溶液(用浓氨水调pH 10.5) －乙腈（83∶17），流速：2.0 ml/min。
        2.2.2  分析HPLC色谱条件  DiamonsilTM C18柱 (5 μm, 250 mm× 4.6 mm)，柱温30℃；检测波长345 nm；流动相为0.03 mol/L的磷酸二氢钾缓冲液－乙腈（74∶26），流速1.0 ml/min。
        2.2.3  去氢紫堇碱对照品的制备纯化  取去氢紫堇碱粗提物1.0 g，用10 ml甲醇超声溶解，过0.45 μm滤膜，备用。吸取1.0 ml样品进半制备型高效液相色谱仪，收集保留时间所在的组分，减压回收溶剂，得去氢紫堇碱粉末。加乙醇适量溶解，重结晶，即得。
        2.3  样品纯度检测及结构鉴定
        2.3.1  晶形确定  取少许冷冻干燥絮状物于表面皿中, 加少量无水乙醇溶解, 常温下放置3 d, 黄色柱状结晶析出。
        2.3.2  薄层色谱检测  薄层板：高效薄层层析板(GF254)。3种展开剂系统：以氯仿-甲醇（5∶1）；氯仿-甲醇-醋酸乙酯(8∶1∶1)；乙醚-环己烷-甲醇（5∶3∶1）。点样：在同一板上，按5，10，15，20，25 μl不同的浓度点样。展距8 cm，定位后经紫外254 nm，碘蒸气及碘化铋钾溶液显色检视。结果在薄层色谱同一位置处，均为单一斑点，未见杂质斑点，符合化学品要求。
        2.3.3  紫外检测  取去紫堇碱对照品乙醇溶液经紫外光谱扫描，结果表明最大吸收波长为345 nm。因此，确定345 nm为测定波长。
        2.3.4  面积归一化法  精密称取去氢紫堇碱对照品，用流动相制成浓度为0.13 mg·ml-1的样品溶液，照“分析HPLC色谱条件”，进样10 μl，样品显示为单峰，用面积归一化法计算含量为98.7％（保留时间为 min），符合中药化学对照品含量测定用要求，结果见图1。
        2.3.5  结构鉴定  去氢紫堇碱为黄色晶状柱晶（乙醇），熔点135℃。EI-MS m/z:366［M］+1 .1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.97 (3H, s, CH3 -13), 3.24 (2H, t,J = 5.2 Hz, 5-H), 3.94 (3H, s, OCH3), 3.99 (3H, s, OCH3), 4.05 (3H, s, OCH3), 4.02 (3H, s, OCH3), 5.03 (2H, t, J = 5.2 Hz, 6-H), 6.93 (1H, s, 4-H), 7.19 (1H, s, 1-H), 7.87 (1H, d, J = 9.6 Hz, 12-H), 7.99 (1H, d, J = 9.6 Hz, 11-H), 10.11(1H, s, 8-H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 18.0(CH3 - 13), 28.1 (C-5)，56.3, 56.6, 57.0(3OCH3)，57.5 (C-6)，62.6 (OCH3), 110.8 (C-4)，113.3(C-1)，119.2 (C-13)，120.3 (C-11)，121.6 (C-12a)，125.7 (C-12)，129.4 (C-8a), 131.9 (C-4a), 133.8 (C-13b), 136.5 (C-13a)，145.1(C-8)，145.7(C-10)，147.9 (C-2), 150.4 (C-3)，151.4 (C-9)。以上波谱数据与文献报道［6］的一致，故鉴定为去氢紫堇碱。
        2.4  延胡索药材中去氢紫堇碱的含量测定
        2.4.1  色谱条件与系统适应性实验   照“分析HPLC色谱条件”项，样品的理论塔板数均大于8000，分离度均大于2.7（见图2），说明该方法用于延胡索中样品去氢紫堇碱的含量测定可行。
        2.4.2  供试品的制备称取延胡索粗粉约1 g，精密称定,置20 ml具塞三角瓶中，加入1％的盐酸甲醇20.00 ml，称重，40 ℃超声提取30 min，取出，补足减失重量，冷却，滤过，取续滤液10.00 ml，回收乙醇，流动相定容至10.00 ml，过0.45 μm滤膜，备用。
        2.4.3  线性范围考察  精密称取去氢紫堇碱对照品0.0153 g于20 ml容量瓶中，用流动相定容，得去氢紫堇碱储备液。再从中取1.00 ml置于10 ml容量瓶中，用流动相定容，得浓度为76.5 μg·ml-1的对照品标准溶液。分别精密吸取对照品标准溶液1，2，3，4，5，6 μl注入色谱仪，记录峰面积。以色谱峰积分面积为纵坐标 (Y)，去氢紫堇碱的进样量为横坐标 (X)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=5 457.104 2X-17.122 1，r=0.999 8，样品在0.076 3～0.457 6 μg浓度范围内线性关系良好。
        2.4.4  精密度实验  精密吸取同一对照品液3 μl，照前述色谱条件重复进样6次，测得去氢紫堇碱峰面积积分值的RSD为0.67%，表明测定仪器精密度良好。
        2.4.5  重复性实验  取同一批样品，按“供试品溶液的制备”方法，平行制备供试品溶液6份，按前述色谱条件进样10 μl，测得去氢紫堇碱总含量平均值为0.9713 mg·g-1，RSD为2.48 %，表明测定方法重复性良好。
        2.4.6  稳定性实验  将同一份供试品溶液放置0，2，4，8 h后，照前述色谱条件进样10 μl，测得去氢紫堇碱在8 h内峰面积的RSD为1.79%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。
        2.4.7  回收率实验  取已知含量的样品约0.5 g，共6份，精密称定，分别加入不同量的去氢紫堇碱对照品，按“供试品溶液的制备”方法制备，按前述色谱条件进样10 μl，测得去氢紫堇碱的平均回收率为104.44 %，RSD为2.36 %（n = 6），表明测定方法准确可靠。结果见表1。表1  回收率实验
       3  讨论
        延胡索生物碱类大部分属于小檗碱或原小檗碱型，它们性质相差较小，极性相近，前人对去氢紫堇碱的分离采用的均是常压硅胶柱法，效率较低。本研究通过常规方法分离得到去氢紫堇碱粗品，再用反相高效液相色谱法提纯去氢紫堇碱，方法简便易行，产品纯度好，成本低，适合去氢紫堇碱对照品的大量制备。
        目前采用反相高效液相色谱测定延胡索中去氢紫堇碱含量文献报道很少,大部分是关于延胡索乙素含量的测定,这难以全面反映延胡索药材的内在质量。测定去氢紫堇碱在延胡索中的含量，对于控制延胡索产品的质量具有重要的意义。
        
       【参考文献】
         ［1］ 付小勇，梁文藻，涂国土. 东阳元胡块茎中生物碱的化学研究［J］.药学学报, 1986, 21(6) : 447.
       
       ［2］ 高学敏. 中药学［M］.北京：人民卫生出版社, 2000：1061.
       
       ［3］ 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社, 2005：94.
       
       ［4］ 马 红. 扶正益肺巴布膏中延胡索乙素的含量测定［J］.中国中药杂志，2007，32 (17)：1819.
       
       ［5］ 龙 进，涂文升. 反相高效液相色谱法测定胃药胶囊中延胡索乙素的含量［J］.中国中药杂志，2004, 29 (9)：914.
       
       ［6］ W u TS, Leu YL, Kuoh CS, et a1． Cytotoxic principles from Saussurea lappa and Coryalis turtshaninovii f．yanhusuo［J］.Journal of the Chinese Chemical Society, 1997，44：357.