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       【摘要】 
       目的观察8-硝基白杨素(NOChR)抑制人急性髓性白血病细胞系（HL-60）细胞增殖和诱导凋亡作用，并探讨其作用机制是否与PTEN-Akt信号传导途径相关。方法体外培养HL-60细胞。MTT比色法检测增殖活性；流式细胞术（FCM）定量分析细胞凋亡程度；Western Blot分析HL-60细胞PTEN、P-Akt蛋白表达的影响。结果NOChR显著抑制HL-60细胞增殖，呈浓度依赖性，其IC50值为1.34 μmol/L；NOChR具有诱导HL-60细胞凋亡作用，且呈浓度和时间依赖性。NOChR以浓度和时间依赖方式上调HL-60细胞PTEN蛋白表达和抑制P-Akt蛋白表达，其作用可被PPARγ特异性阻断剂GW9662(10 μmol/L)预孵育拮抗。结论NOChR诱导HL-60细胞凋亡作用与其活化PPARγ，上调PTEN蛋白表达，抑制抑制Akt磷酸化相关。
       【关键词】  人急性髓性白血病 白杨素 凋亡
       白杨素(ChR)是一种具有广泛生物活性的黄酮类化合物，在蜂胶中含量较高，具有抗氧化、抗病毒、抗高血压病、抗糖尿病等药理作用。以往的实验研究表明，ChR抑制人甲状腺癌细胞生长；通过拮抗雌激素受体，抑制人乳腺癌细胞DNA合成；通过调控肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达诱导人肝癌细胞凋亡。我们研究发现8－硝基白杨素(NOChR)抑制人胃癌(SGC-7901)细胞、人结肠癌(HT-29)细胞作用较白杨素更强［1］。Song等［2］报道白杨素具有抑制蛋白激酶CK2,上调肿瘤抑制基因产物PTEN蛋白表达，抑制Akt磷酸化作用。Kanamori等［3］对子宫内膜癌的研究显示,PTEN蛋白表达丢失组织中Akt磷酸化水平明显升高,两者呈显著负相关。本研究旨在观察NOChR抑制HL-60细胞增殖和诱导凋亡作用及其与PTEN-Akt途径的相关性。
       1   材料和方法
       1.1    细胞与细胞培养 HL-60细胞购于中国典型培养物保藏中心(中国武汉市)，用含体积分数为10%的胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基在体积分数5%CO2，37℃，饱和湿度的细胞培养箱内培养，2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
       1.2   药品与试剂 NOChR参照文献［4］方法合成，分子量299，黄色晶体，纯度99.0％。ChR为美国Sigma公司产品，全反式维甲酸、二甲基亚砜(DMSO)和GW9662为美国Sigma公司产品；鼠抗人PTEN单克隆抗体，鼠抗人P-Akt单克隆抗体及兔抗鼠IgG多克隆抗体由Santa Cruz生物公司生产，购于北京中杉金桥生物技术有限公司，小牛血清为杭州四季青生物有限公司产品；胎牛血清购于天津灏洋生物；PVDF膜购于Pall公司；胰酶、MTT购于Ameresco公司；1640培养基由GiBco公司生产。
       1.3   MTT比色  细胞接种于96孔培养板,加入20 μl不同浓度NOChR、先导化合物ChR和阳性药物ATRA，使其终浓度分别为0.1，0.3，1.0，3.0和10.0 μmol/L，空白对照组加相同体积的PBS溶液。每组设4个复孔，处理48 h。加入MTT液20 μl，继续培养4 h后，离心5 min，弃上清，加入DMSO100 μl,振荡溶解；在570 nm波长测吸光度(A)值。计算相对增殖抑制率(IR)，IR(%)=(1-实验组A均值÷对照组A均值)×100%。以上实验重复3次。
       1.4    PI染色FCM分析 HL-60细胞经无血清培养基处理24 h后，用含不同浓度药物的培养基分别处理48 h后，收集细胞，用PBS吹打细胞成单细胞悬液，冷PBS洗2遍，用4℃的70%乙醇固定24 h后，碘化丙啶(PI)染色，上流式细胞仪(美国BD公司，FACS420)检测细胞凋亡情况。
       1.5   Western blot分析 用1640培养基调整HL-60细胞浓度为2×104/ml接种于培养板中，每孔1 ml，加入10.0 μmol/L的NOChR孵育0，4，8，24 h；收集细胞，于4℃裂解液中裂解，离心后进行蛋白定量，用胎牛血清作为标化对照组，加缓冲液(42mM Tris-Cl，10% glycerol，2.3% SDS，5% 2-mercaptoethanol和0.02% bromophenol blue)，煮沸5 min后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白被转移到PVDF膜上，分别用鼠抗人PTEN、p-Akt抗体孵育，加入过氧化物酶标记二抗并使胶片感光。用PPARγ特异性阻断剂GW9662实验检测NOChR是否通过活化PPARγ调控PTEN和p-Akt蛋白表达。实验重复3次。
       1.6   统计学处理 各组实验数据均用±s表示，采用SPSS windows 11.5软件One Way ANOVA方式行方差分析,两两比较采用Student"s t检验。
       2  结果
       2.1   NOChR对HL-60细胞生长抑制作用 不同浓度的NOChR，ATRA，ChR分别作用48 h后，NOChR能显著抑制HL-60细胞的增殖，呈剂量依赖性，其IC50值为1.34 μmol/L。NOChR抑制HL-60细胞增殖作用的效价强度高于先导化合物ChR（P＜0.05），与阳性对照物ATRA相当。见表1。
       表1  NOChR对HL-60细胞的生长抑制作用（略）
       与ChR组对比，*P ＜0.01;n=4
       2.2  8－硝基白杨素对HL-60细胞凋亡的影响 NOChR诱导HL-60细胞凋亡率达23.16%，而相同浓度ChR的凋亡率仅为5.8%，阳性对照药物ATRA诱导的凋亡率是9.75%。见图1。
       图1  PI染色FCM分析8－硝基白杨素诱导HL-60细胞凋亡（略）
       2.3  NOChR对HL-60细胞PTEN-Akt信号途径影响  提示NOChR以时间依赖方式上调HL-60细胞PTEN蛋白表达，较0 h分别上调（80.2±12）%,（109±24）%和（119±27）％；以时间依赖方式下调HL-60细胞p-Akt蛋白表达，较0h分别下调（7.9±2）%,（65.5±6）%和（89.5±9）％(见图2)。PPARγ特异性阻断剂GW9662 10.0 μmol/L预孵育30 min后，NOChR作用HL-60细胞24 h,发现GW9662能有效拮抗NOChR的上调HL-60细胞PTEN蛋白表达作用见图3。
       图2  Western blot分析NOChR1.0 μM对HL-60细胞PTEN、p-Akt蛋白表达的影响（略）
       图3  PPARγ特异性阻断剂GW9662对NOChR调控HL-60细胞PTEN蛋白表达的影响（略）
       3  讨论
          
       细胞凋亡（Apoptosis）是指在特定时空发生的、受机体严密调控的细胞“自杀”现象，与细胞恶性增殖和分化受阻一样，细胞凋亡异常在大多数恶性肿瘤的发病学上占有重要的地位，而抑制增殖和诱导凋亡可能是不同作用机理的化疗药物发挥抗肿瘤作用的共同通路。本实验证实NOChR以浓度依赖方式抑制HL-60细胞增殖，其作用效价强度是先导化合物ChR的5.3倍。PI染色流式细胞术（FCM）分析发现，NOChR（1.0 μmol/L）作用48h的HL-60细胞凋亡率达23.16%，而相同浓度ChR的凋亡率仅为5.8%，阳性对照药物ATRA诱导的凋亡率是9.75%。提示：NOChR对HL-60细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用，且作用效价高于ChR。
       
       PTEN是近期发现的一种新型肿瘤抑制基因，现已证明PTEN基因是第1个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，不仅参与细胞周期的调控，而且调节细胞的正常生长和发育，最终促进细胞凋亡。PTEN可以特异性地抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)依赖的蛋白激酶B(PKB或Akt)的激活，而PI3K催化细胞膜上的(磷酸)肌醇磷酸化产生PIP2与PIP3，PIP3激活下游的Akt。PTEN可以去磷酸化PIP3 ，拮抗PI3K的活性，降低细胞内PIP3的浓度，从而抑制Akt的激活。活化的Akt是促进细胞存活因子,能降低凋亡促进因子活性和增加抗凋亡蛋白的活性［5］，Akt能够磷酸化Bad，后者释放被其抑制的抗凋亡蛋白Bcl-xL，磷酸化的Bad还通过阻断细胞色素C的释放参与抗凋亡；Akt通过磷酸化抑制Caspase-9的活性抑制凋亡。过氧化物酶体增殖体激活受体PPARγ是一个核受体转录因子,能够上调PTEN的表达；而PPARγ拮抗剂GW9662能够抑制PPARγ配体的这种作用［6］。多种恶性肿瘤存在PTEN基因的突变或缺失，导致PI3K/Akt信号通路活性增高，Kandasamy等［7］在肺癌细胞中转染PTEN可下调Akt水平，降低其对TRAIL凋亡途径的抵抗性。因此，设法上调PIEN，抑制P-Akt表达，不失为抗肿瘤的一种途径。本实验用Westernblot分析发现，NOChR以时间依赖方式上调HL-60细胞PTEN蛋白表达和抑制P-Akt蛋白表达。NOChR的上调HL-60细胞PTEN蛋白表达作用可被PPARγ特异性阻断剂GW9662(10 μmol/L)预孵育拮抗。说明NOChR可能通过活化PPARγ，上调PTEN蛋白表达，抑制Akt蛋白磷酸化，诱导HL-60细胞凋亡。
       【参考文献】
         　　［1］ Zheng X, Meng WD, Xu YY, et al. Synthesis and Anticancer effect of Chrysin derivatives［J］. Bioorg Mde Chem Lett, 2003.Mar 10; 13(5):881.
       
       ［2］ Song DH, DoMinguez I, Mizuno J, et al. CK2 phosphorylation of the ArMadillo Repeat region of β-catenin Potetiates Wnt signaling［J］. J Biol CheM. 2003,278(26):24018.
       
       ［3］ Kanamori Y, Kigawa J , Itamoch i H, et al. Co rrelation between loss of PTEN exp ression and A k t phosphorylation in endometrialcarcinoma［J］. Clin Cancer Res, 2001, 7 (4) : 892.
       
       ［4］ Zheng X, Meng WD, Xu YY, et al. Synthesis and Anticancer effect of Chrysin derivatives［J］. Bioorg Mde Chem Lett, 2003.Mar 10; 13(5):881.
       
       ［5］ Mayo L D , et al. The PTEN , Mdm2 , p53 tumor suppressor-onco-protein network［J］. Trends Biochem Sci , 2002 , 27 (9) : 462.
       
       ［6］ Farrow B , et al. Activation of PPARgamma increases PTEN expression in pancreatic cancer cells［J］. Biochem Biophys Res Commun ,2003 , 301 (1) : 50.
       
       ［7］ Kandasam Y K, Srivastava R. Rale of the phosphatidylinositol 3" -kinase/PTEN/Akt Kinase pathway in tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-indued apoptosis in non-sinall cell lung cancer cells［J］ . Cancer Res, 2002,62(9):4929。