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       【摘要】 
       目的建立何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性（SRAP）分子鉴定技术体系。方法正交优化影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量。结果 20 μl反应体系的优化组合为：Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.4 mmol/L，引物0.35μmol/L，Taq酶1U。结论Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量对不同物种SRAP-PCR结果有不同程度影响，利用SRAP分子鉴定前应对此4因素进行优化。
       【关键词】  何首乌 混伪品 序列相关扩增多态性 优化
       Optimization of SRAP-PCR in Polygonum multiflorum Thunb. and its Adulterants
       GUO Jun, ZHAO Shujin*, ZHENG Chuanjin
       （School of Bioscience & Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China； Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Commant, Guangzhou, 510010, China）
       Abstract：ObjectiveIn order to characterize Polygonum multiflorum Thunb. and its adulterants, the SRAP molecular marker system was established.MethodsOrthogonal design was used to optimize the concentrations of Mg2+, dNTPs, primers and Taq DNA olymerase. ResultsThe optimum system of 20 μl was as follows: Mg2+ 2.5 mmol/L, dNTPs 0.4 mmol/L, primer 0.35 μmol/L, Taq DNA polymerase 1 U. ConclusionThe concentrations of Mg2+, dNTPs, primers, Taq DNA olymerase have different effect in the result of SRAP-PCR in different species. It is necessary to optimize these four factors before using SRAP to identity different species.
       Key words：Polygonum multiflorum Thunb.;   Adulterants;   SRAP;  Optimize
       
       何首乌Polygonum multilorum Thunb.是我国传统名贵中药，广东十大“道地药材”之一。近年来对其药理药效研究及开发应用越来越广。据研究报道其药用化学成分主要有蒽醌类、二苯乙烯类、芪类、多糖类等［1～4］。何首乌具有降血脂［2］、增强免疫［3］、抗氧化［4］、护脑［5］等多种药效。除入药外，还被用于制取洗发水、首乌酒、保健品、食品和饲料添加剂等，开发前景十分广阔［6］。
       
       然而，何首乌出现混伪品的历史久、地域广。本草中有混淆品宕芋的记载；河南、河北、甘肃、宁夏等地也有将翼蓼、毛脉蓼误做何首乌使用的历史［7］；湖北省武当山、竹山、竹溪、房县均有把混淆品耳叶牛皮消作何首乌使用的习惯［8］，且有不法商贩雕刻芭蕉块根为“人型何首乌”出售。混伪品的出现严重阻碍何首乌科研及应用，因此对何首乌及其混伪品的鉴定显得至关重要。
       
       序列相关扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)以操作简单、稳定性高、多态性丰富、易于测序［9～12］等优点在种质鉴定［13］、遗传多样性分析［11］、遗传连锁图构建［14］、基因连锁标记寻找［9］与基因的遗传变异［14，15］等方面得到广泛应用。且Ferriol等［16］发现与其它分子标记相比，SRAP在分子水平上与传统在形态学水平上建立的物种分类鉴定更加吻合。
       
       SRAP分子鉴定技术基于PCR反应。一个优化的PCR反应体系极其重要，这关乎样本DNA所能扩增的条带数、清晰度及稳定性，从而影响后续的统计分析。为建立何首乌及其混伪品SRAP分子鉴定技术，本文首次对何首乌及其混伪品SRAP-PCR反应体系的主要影响因素进行了优化，以期为何首乌及其混伪品鉴定提供前提条件。
       1   材料和方法
       1.1   材料实验所用引物及物种见表1～2。实验所用DNA聚合酶，TaKaRa Taq (DR001AM)。BSA（牛血清白蛋白），购自TaKaRa。
       表1  实验所用引物（略）
       1.2   DNA提取用TIANGEN的DNAsecure Plant Kit提取经硅胶干燥保存的各物种叶片DNA，紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量合格，稀释为50 ng/μl，-20℃保存。
       表2  实验所用物种（略）
       1.3   SRAP-PCR扩增采用L16 (45 )正交实验设计，对总体积为20μl的SRAP反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度进行4因素4水平的优化分析(表3～4)，共16个处理。其它成分为：DNA模板（50 ng/）1 μl、Buffer（10X）2 μl、BSA（0.1%）0.2 μl，超纯水补足使终体积为20 μl。所用引物对为me17-em1。
       表3  PCR反应的因素与水平（略）
       扩增程序：94℃预变性5 min；95℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸1 min，5循环；94℃变性1 min，48℃复性1 min，72℃延伸1 min，35循环；72℃延伸7 min。PCR在PE-2400型PCR仪上进行。
       1.4   SRAP-PCR产物检测取8 μlPCR产物与2 μl上样缓冲液，混合后在含有0.5 μg/mLEB的2%琼脂糖凝胶上电泳40 min，Bio-Rad凝胶成像系统上观察和记录结果。
       表4  PCR反应因素水平L16(45)正交实验设计μl（略）
       2  结果
       2.1   正交实验结果按表4分别对9物种进行PCR反应后，所得产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测（见图1）。
       图1  9物种SRAP-PCR正交电泳结果（略）
       
       根据图1电泳结果，按条带数、清晰度分别给9物种独立打分，最佳记7分，最差为1分。见表5。
       2.2  分析对表5评分进行直观分析，各物种4因素的最佳水平、直观分析最佳组合见表6。
       
       将表5评分用统计软件SPSS V13.0进行方差分析，各物种所得结果中的F值与Sig值见表7。其中Sig<0.05代表0.05水平下差异显著。
       
       由表6可知各物种SRAP-PCR 4因素的最佳水平及最佳反应体系组合不完全相同。其中Mg2+、引物、酶的2号水平，dNTPs的3号水平相对于各因素其它水平，为最佳水平次数最多。有6物种正交16个处理中8号处理扩增结果最优。
       
       由表7可知4因素对各物种扩增结果影响显著度有差异。其中引物浓度对卷茎蓼、耳叶牛皮消、头花千金藤SRAP-PCR扩增影响不显著，酶浓度对齿叶蓼SRAP-PCR扩增影响不显著，其它情况4因素对扩增结果都具显著影响。纵观9物种，多以Mg2+影响最为显著，Sig值均在0.004以下；dNTPs显著性次之。
       
       4因素对各物种SRAP-PCR影响显著性及最佳水平均不相同，没有统一的最佳组合，因此折中选择9物种都具良好扩增的统一体系。其中正交8号处理在毛脉蓼、齿叶蓼、卷茎蓼、木藤蓼、翼蓼、耳叶牛皮消6物种SRAP-PCR扩增中都取得了最佳效果，在其余3物种何首乌、齿翅蓼、头花千金藤中也取得了仅次于最好处理的扩增效果。因此，选定8号处理（Mg2+=2.5 mmol/L、dNTPs=0.4 mmol/L、引物=0.35 μmol/L、Taq酶=1U）为SRAP鉴定何首乌及其混伪品的反应体系。利用此优化条件，选用引物对me4-em5做验证实验（图2）。从电泳结果可知9物种都有较好的扩增，证明此条件可作为SRAP鉴定何首乌及其混伪品的反应体系。
       表5  9物种SRAP-PCR各处理扩增电泳结果得分（略）
       3  讨论
          
       Mg2+是Taq酶的激活剂，过低不能有效激活Taq酶，过高又会抑制酶活。dNTPs是PCR反应的“原料”，在Taq酶的催化下与DNA单链模板互补配对实现PCR反应的延伸，过低量的dNTPs会使DNA扩增产量减少，电泳条带模糊，过量的dNTPs一方面会与Taq酶竞争Mg2+使Taq酶活降低，另一方面会增加错配率从而影响扩增效率。引物的浓度也要适量，过低时扩增条带较少，引物浓度过高会促使引物错误引导非特异性产物。Taq聚合酶用量的多少直接影响PCR反应的成败，酶用量过低酶活力单位少，电泳条带较暗甚至消失，酶量过高，会增加非特异性产物。因此，Mg2+、dNTPs、引物及Taq酶浓度均会影响PCR扩增的结果，在PCR时必须对其进行优化处理。
       
       单因素优化试验直观简便，结果的判断准确，但考察组合搭配覆盖面小，各因素的最佳水平组合不一定最优。正交优化更具科学性，条件覆盖面广，但在本文中条带优劣判断存在较大人为主观，增加了误差。因此，实验方法应依据实验目的进行取舍。本实验文为找到9物种的统一的良好反应体系，考察的体系组合覆盖面要广，选用了正交优化。
       表6  各物种直观分析（略）
       表7  9物种方差分析（略）
       *表示0.05水平下显著
       图2  me4-em5验证实验（略）
       
       SRAP标记与已有的分子标记技术相比有很多优点。与AFLP技术相比较而言，它省去了酶切、连接、预扩增等烦琐的步骤，节约了费用和时间，同时又简便可靠，得到的目的条带便于测序。与RAPD技术相比SRAP稳定，重复性好。Budak［10］等以野牛草为材料发现SRAP比RAPD，SSR，和ISSR有更丰富的多态性和更强的区分鉴别能力。本文SRAP标记技术体系的建立将为何首乌及其混伪品鉴定奠定基础。
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