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       【摘要】 
       目的研究微波提取苦丁茶总黄酮的最佳提取条件。方法通过二次回归正交旋转组合试验设计，得到了微波提取苦丁茶中黄酮的数学回归方程；利用模型的响应曲面图及等高线图，对影响微波提取苦丁茶黄酮提取率的关键因素及相互作用进行探讨，得到最佳提取工艺条件。结果最佳提取工艺条件：乙醇浓度69%，微波功率782 W，萃取时间4.5 min，料液比1∶15，苦丁茶黄酮提取率为9.10%。结论该工艺条件可为工业生产提供参考数据。
       【关键词】  响应面法 苦丁茶 黄酮 微波提取
       Study on the Techniques of Microwave Extraction of Flavonoids from Kudincha Using Response Surface Method
       LIU Zhixiang, HAN Lei, ZENG Chaozhen
       (College of Life Science and Technology,Central   South University of Forestry and Technology, Changsha, 410004, China)
       Abstract:ObjectiveTo study the extraction conditions of flavonoids from Kudincha using microwave technology.MethodsBy means of orthogonally rotational combination design, microwave extraction mathematical simulation model was concluded by the linear regression analysis. In order to obtain the optimum extraction of flavonoids, the regression equation of the relationship between the four factors were established. ResultsThe optimum extractive conditions for flavonoids were microwave  power 782W, ethanol 69%, ratio of solid to liquid 1∶15, extraction time 4.5min.The  extraction rate could reach up to 9.10% under these conditions. ConclusionThe procedure of the extraction can be helpful to the factory-scale production.
       Key words:Response surface method(RSM);  Kudincha;  Flavonoids;  Microwave extraction
       
       苦丁茶中含有大量的黄酮、蒽酮类化合物、生物活性多糖、香豆素类内酯、特种氨基酸、芳香成分。它具有消炎、扩张冠状动脉、增加冠脉流量、影响血压、改善微循环、解痉、抑菌、抗肝炎病毒、抗肿瘤等功效［1，2］。
       
       响应面法(RSM)是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对函数响应面和等高线的分析，能够精确地研究各因子与响应值之间的关系，寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法［3］。它具有实验次数少、周期短、精度高等优点［4］，已经在食品、医药、生物工程、天然物提取等领域广泛的应用。本实验应用响应面法对苦丁茶总黄酮的微波提取工艺条件进行了优化，取得较高的提取效率。
       1  材料与方法
       1.1  材料湖南产冬青大叶苦丁茶。
       1.2  方法
       1.2.1  工艺流程苦丁茶→粉碎→80目过筛→按一定料液比加溶剂和原料→微波处理→过滤→定容→铝盐反应→波长510 nm处测吸光度。
       1.2.2  标准曲线的制作［5］回归方程为：A=9.503 6C-0.023 1（R2=0.995 8）       （1）
       1.2.3  四元二次通用旋转组合实验设计方案本实验选择微波功率（Z1）、乙醇浓度（Z2）、萃取时间（Z3）、液料比（Z4）为参试因子，每个因子的各个水平列于表1。
       表1  四元二次通用旋转组合设计因素水平（略）
       1.2.4  实验数据处理实验所得数据，采用SPSS11.5统计分析软件进行回归分析，并对回归模型及回归模型中各项的显著性进行检验，剔除非显著项，确定简化回归模型方程。同时对实验中各参试因子进行方差分析，并利用Statistica 6.0软件绘出3D曲面图，分析各参试因子对微波提取苦丁茶中的总黄酮效果的影响。
       2  结果
       2.1  提取工艺条件优化数学模型的建立与统计检验见表2。
       
       对表2的数据用SPSS统计软件进行线性回归分析，检验回归模型拟合度及其显著性，同时对回归模型方程中各项进行方差分析，结果见表3～4。
       
       由表3～4可知，回归模型拟合度较好，复相关系数（R2 = 0.924）表明回归模型较好地拟合了黄酮得率与各参试因子之间的关系，模型得出的结论较为可靠。剔除不显著项，得到以黄酮提取率为目标函数的二次回归数学模型：
       
       Y=0.297X1-0.174X2-0.231X3+0.158X1X2-0.173X12-0.232X22-0.178X32+0.142X42+8.32    （2）
       2.2  主因子效应分析由于方程是经无量纲线性编码代换后所得，方程中各项回归系数已经标准化，因此可以直接比较其绝对值的大小来判断各因子的重要性。从线性项看，B1 >∣B3∣>∣B2∣>B4，说明微波功率对黄酮的提取率影响最大，其次是提取时间、乙醇浓度、料液比。
       2.3  单因子效应分析由回归系数显著性检验结果可知，微波功率、提取时间、乙醇浓度对黄酮提取率有极显著影响。因此选取这3因子进行单因子效应分析。采用降维分析方法，将其它因子固定在0水平，可得到单因子的效应方程，来描述此因子变动对Y值的影响。单因子效应曲线如图1所示。
       表2  四元二次通用旋转组合实验结果（略）
       X1=(Z1-590)/236；X2= (Z2-70)/10；X3=(Z3-5)/1；X4=(Z4-25)/5
       表3  回归模型的方差分析（略）
       表4  回归模型各项方差分析（略）
       **表示极显著；*表示显著
       
       由表5可以发现，微波功率、乙醇浓度、萃取时间的单因子效应方程均为二次曲线型，说明微波功率、乙醇浓度、萃取时间对黄酮提取率的影响都表现为曲线变化。当码值为表5中的X时各个方程对应的Y有最大值Ymax，当码值小于X时，微波功率、乙醇浓度、萃取时间的值升高黄酮提取率增加，呈正效应，当码值大于表中的X时则呈负效应。码值X对应的微波功率、乙醇浓度、萃取时间分别为792.5w，66.27%，4.35 min，此时黄酮提取率最高，即表中的Ymax。
       图1  单因子效应曲线（略）
       表5  主因子的单因子效应方程（略）
       2.4  因子边际效应分析将单因子效应方程求一阶偏导数，得到单因子的边际效应方程，边际效应可反映目标函数(Y) 随自变量变化而变化的速率。选取微波功率、提取时间、乙醇浓度进行因子边际效应分析，其边际效应方程如下：
       
       dY/dX1= 0.297-0.346X1
       
       dY/dX2=-0.174-0.464X2
       
       dY/dX3= -0.231-0.356X3
       
       根据方程作图，得到边际效应曲线图（见图2）。
       图2  单因子边际效应曲线（略）
       
       由图2可以看出，当微波功率编码值小于0.858时，随着微波功率的升高，黄酮的提取率在增加，但增加的速率逐渐降低；当微波功率码值大于0.858时，随微波功率的升高，黄酮的提取率下降，而且下降的速率逐渐增大。
       
       当乙醇浓度编码值小于-0.375时，随着乙醇浓度的升高，黄酮的提取率在增加，但增加的速率逐渐降低；当乙醇浓度码值大于-0.375时，随乙醇浓度的增加，黄酮的提取率下降，而且下降的速率逐渐增大。
       
       当提取时间编码值小于-0.649时，随着料液比的升高，黄酮的提取率在增加，但增加的速率逐渐降低，当料液比码值大于-0.649时，随提取时间的升高，黄酮的提取率下降，而且下降的速率逐渐增大。
       2.5  因子交互效应分析由回归方程偏回归系数显著性检验可知，微波功率（X1）和乙醇浓度（X2）之间存在显著交互作用，其它因子间的交互作用均不显著。因此只分析X1和X2之间的互作效应。
         
       X1与X2的交互效应曲线如图3所示。从图3中可以看出，当X1的码值在0.2～1.4 间时，X2的码值为-0.6～0.4间时，其交互效应达到最大。
       图3  微波功率—乙醇浓度的交互作用响应曲面图及等高线图（略）
       2.6  回归方程局部最优点的寻找利用Lindo软件，使各个参试因子在-2～2范围内，对回归方程进行规划求解，得到黄酮的提取率（Y）的最大值以及各参试因子的具体取值：X1= 0.814；X2=-0.098；X3= -0.649；X4= -2。然后通过式（3）代入原编码水平求出该模型中各参试因子的具体取值。
       
       Zj = Z0j+ Xj × Δj      （3）
       
       故微波提取苦丁茶中黄酮的理论最优条件是，微波功率782.1 W，乙醇浓度69.02%，提取时间4.5 min，液料比15∶1，微波提取黄酮的理论提取率可达9.10%。
       2.7  最优工艺条件验证以乙醇浓度69%，微波功率782 W，萃取时间4.5 min，液料比15∶1为萃取条件，进行微波提取最优工艺的验证试验，并与理论值相比较，微波提取理论得率与验证试验结果基本一致，理论值为9.10%，验证试验值为(9.13±0.052)%，由此表明试验中所设模型与实际情况相符，回归模型可靠。
       3  结论
           
       实验表明微波功率、乙醇浓度、萃取时间、液料比对苦丁茶总黄酮得率的影响不是简单的线性关系，一次项和二次项对苦丁茶总黄酮得率影响显著，交互项影响较小。
       
       响应面法优化微波提取苦丁茶总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度69%，微波功率782 W，萃取时间4.5 min，液料比15∶1，苦丁茶黄酮提取率为9.10%。回归分析和验证实验表明了该响应面法的合理性和可行性。
       【参考文献】
         　　［1］ 姚晓敏,孙向军,张 英.苦丁茶资源的综合利用［J］.应用技术市场,2000,11:2.
       
       ［2］ 毛莉娟,刘学文,冉 旭.苦丁茶中黄酮的提取工艺［J］.食品科技,2002,11:18.
       
       ［3］ 褚以文.微生物培养基优化方法及其OPTI优化软件［J］.国外医药·抗生素杂志分册,1999,20(2): 58.
       
       ［4］ 慕运动.响应面方法及其在食品工业中的应用［J］.郑州工程学院学报,2001,22(3): 91.
       
       ［5］ 黄林芳,万德光.川产苦丁茶中总黄酮的含量测定［J］.时珍国医国药,2004,15(6):327.