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       【关键词】  苦丁茶冬青叶多糖；,,提取；,,苯酚
       摘要：目的研究苦丁茶冬青叶多糖含量的测定方法。方法以水提醇沉的方法从苦丁茶冬青叶中提取得到苦丁茶冬青叶多糖并以正交实验优化显色条件，采用苯酚-硫酸法测定其多糖含量。结果测定波长为482 nm，最佳显色条件为6%苯酚用量1.0 ml，浓硫酸用量7.0 ml，反应时间40 min。标准曲线回归方程为A＝0.054 6C-0.003 3（n＝10），r＝0.999 8，并在2.51～45.11 mg・L1范围内呈良好线性关系。平均回收率为98.55％，RSD＝1.86％（n＝5）。测得多糖平均含量为31.90％，RSD＝1.75％（n＝6）。结论该方法简单、准确、重现性好，可为其继续研究开发及应用提供参考依据。
       关键词：苦丁茶冬青叶多糖；  提取；  苯酚硫酸法；  含量测定；  正交实验
       Extraction and Determination of the Polysaccharides from the Leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng
       WANG Xin， LU Huining*， LIN Shaokun
       (Instrumental Analysis & Research Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China; Department of Pharmaceutical Engineering, Liaoning University, Shenyang 110036, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the determination method for polysaccharides in the leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng.MethodsThe leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng were defatted with 95% EtOH，extracted with water and precipitated with 80% EtOH, and then was deproteined three times by Sevag method, and from which, a crude polysaccharide noted as KPSⅡwas obtained. The traditional colorimetric method applied for the determination of polysaccharides from the leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng was developed by the use of phenylhydrate-sulfuric acid, and was optimized by orthogonal experiment.Results The results showed that the wavelength for measurement was 482 nm. The best colorimetric conditions were the time of reaction of 40 min and the dosage of 6% phenylhydrate and H2SO4 of 1.0 and 7.0 ml, respectively. Linear range was 2.51～45.11 mg・L1(A＝0.054 6C-0.003 3，r＝0.999 8). The average recovery was 98.55% and RSD was 1.86% (n＝5). The polysaccharide content of KPSⅡ was 31.90％ and RSD was 1.75％ (n＝6). ConclusionThe method used in this paper is simple, accurate and stable. The result obtained may act as a base for the further study and application of it.
       Key words：Polysaccharides from the leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng;   Extraction；  Phenylhydrate-sulfuric acid method；  Determination；  Orthogonal experiment
   
　　苦丁茶冬青Ilex kudincha C. J. Tseng是冬青科（Aquifoliaceae）冬青属乔木植物，主产于湖南、湖北、广东、广西、海南等省。叶（苦丁茶）苦、甘、凉。清热解毒，祛暑。主要用于治疗头痛、齿痛、目赤、热病烦渴、痢疾等症［1］。近年来，已有人对苦丁茶冬青叶（苦丁茶）的化学成分和药理作用作了一些研究，为其临床应用提供了一定的理论依据［2］。迄今为止，对其具有生物活性的多糖成分研究未见报道。本文首次从苦丁茶冬青叶中分离提取得到粗多糖，并以正交设计L9（33）优化显色条件，研究了苯酚-硫酸法测定苦丁茶冬青叶多糖含量的方法，为其进一步研究开发与应用提供了参考依据。
       　　1  仪器与材料
       1.1  原料苦丁茶冬青叶水提物精粉。苦丁茶冬青叶由海南澄迈万昌苦丁茶场提供，经晾干、粉碎后，用水于80℃浸提，提取液经浓缩后喷雾干燥得红棕色粉末，密封保存备用。
       1.2  仪器紫外可见吸收光谱仪（UV2501PC，日本岛津公司）；真空干燥箱（8764S型，上海锦屏仪器仪表有限公司）；低速离心机（CL12，新专红旗电机厂）；循环水式多用真空泵（SHBⅢ，郑州长城科工贸有限公司）。
       1.3   试剂苯酚（AR，郑州市德众化学试剂厂），使用前重蒸馏；无水乙醇、无水乙醚、95％乙醇、三氯甲烷、正丁醇、硫酸等均为国产分析纯试剂，使用前未处理。
       　　2  结果
       2.1  多糖的提取［3,4］称取苦丁茶冬青叶水提物喷雾干燥粉末10 g，加入95％乙醇200 ml浸泡过夜，抽滤，取滤渣重复以上操作直至乙醇液无色时止。80 ℃烘干，加入去离子水200 ml溶解，过滤除去不溶物质。向滤液中加入95％乙醇至含醇量达到80％，边加边搅拌，得灰白色絮状沉淀。静置6 h后进行离心分离沉淀，回收上层乙醇溶液，取固体部分再重复溶解、沉淀、离心分离操作至乙醇液澄清无色为止。溶解后，将体积比4 ∶1的三氯甲烷/正丁醇混合液等体积加入多糖溶液中，振荡30 min后，静置，除去中间层变性蛋白质，并收集上层清液，重复以上操作3次去除蛋白。加入4倍95%乙醇醇析，水溶后再醇析2次，固体部分用少量无水乙醇洗涤2次，再用无水乙醚洗涤2次，自然晾干后放入真空干燥箱干燥4 h（50 ℃，0.096 MPa），得浅灰褐色固体，即为苦丁茶冬青叶粗多糖KPSⅡ。
       2.2  含量测定
       2.2.1  最大吸收波长的选择精密吸取352.0 mg・L1苦丁茶冬青叶多糖KPSⅡ溶液1.0 ml置10 ml容量瓶中，加入6％苯酚1.0 ml，混匀，再加入7.0 ml硫酸，混匀后室温放置30 min，以蒸馏水补至刻度，混匀。以蒸馏水替代多糖溶液如上法配制空白，在600～300 nm范围内扫描，确定最大吸收波长。结果见图1。确定最大吸收波长为482 nm。
       图1  苦丁茶冬青叶多糖KPSⅡ显色后紫外光谱图（略）
       2.2.2  显色条件的选择以显色剂6％苯酚用量、硫酸用量和反应时间作为考察因素，采用正交设计L9（33）优选最佳显色条件，因素与水平见表1。实验结果见表2，并采用直观分析法［5］对正交实验结果进行统计分析。结果表明，浓硫酸用量是影响显色条件的最主要因素，显色剂6％苯酚用量的影响次之，而反应时间对结果的影响不大。最佳显色条件为A2B2C3，即6%苯酚用量1.0 ml，浓硫酸用量7.0 ml，反应时间40 min。
       表1   L9（33）正交设计水平（略）
       表2   正交实验结果（略） 
       2.2.3  标准曲线的制备精密称取无水葡萄糖纯品25.06 mg，定容于100 ml容量瓶中，分别吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 ml，按“最大吸收波长的选择”项下方法操作，分别测定吸光度。以横坐标为葡萄糖含量（mg・L1），纵坐标为吸光度值，作标准曲线，结果见图2。求得标准曲线回归方程为A＝0.054 6C-0.003 3（n＝10），r＝0.999 8，在2.51～45.11 mg・L1范围内呈良好线性关系。
       图2  葡萄糖标准曲线（略）
       2.2.4  精密度实验精密吸取352.0 mg・L1苦丁茶冬青叶多糖溶液1.0 ml，按“最大吸收波长的选择”项下方法操作，同时平行测定10瓶。结果见表3。所得吸收度变异RSD＝2.67％，表明精密度良好。
       表3  精密度实验结果（略）
       2.2.5  显色稳定性实验精密吸取苦丁茶冬青叶多糖溶液1.0 ml，按“最大吸收波长的选择”项下方法操作，样品显色后，每隔5 min测定1次吸光度，共测定24次。结果见表4。RSD=0.38％，表明本法对苦丁茶冬青叶多糖显色至少在2 h之内稳定。
       表4  稳定性实验结果（略）
       2.2.6  显色重现性及多糖含量测定精密称取同一苦丁茶冬青多糖KPSⅡ样品6份各约35.0 mg，定容于100 ml容量瓶中，取1.0 ml，按“最大吸收波长的选择”项下方法操作测定吸光度，代入标准曲线方程计算得多糖平均含量（校正因子为0.9［6］）。实验结果见表5，吸光度结果为3次测定平均值，计算得多糖平均含量为31.90％，RSD＝1.75％（n＝6），说明采用本法测定苦丁茶冬青叶多糖含量具有良好的重现性。
       表5  显色重现性及多糖含量测定实验结果（略）
       2.2.7  回收率实验采用加样回收法。取一定体积的苦丁茶冬青多糖溶液，分别加入2.51，5.01，7.52，10.02，12.53 μg葡萄糖，按“最大吸收波长的选择”项下方法操作，测定吸光度，求平均回收率。结果见表6，求得平均回收率为98.55％，RSD＝1.86％（n＝5）。
       表6  回收率实验结果（略）
       　　3   讨论
       为了比较、评价以多糖为有效成分的药材和药品质量，多糖含量测定方法研究具有重要意义。目前应用较多的多糖含量测定方法是苯酚－硫酸法［7］，其原理为多糖在强酸的作用下水解生成单糖，并迅速脱水成糠醛，糠醛与酚性物质如苯酚缩合生成有色化合物，但各自的报道中，对反应温度的控制、试剂中苯酚及硫酸用量、反应时间不尽相同［8］。说明对于不同的含糖物质，应用苯酚-硫酸法，其测定条件是不同的。本实验以正交设计L9（33）优化显色条件，研究了苯酚-硫酸法对苦丁茶冬青叶多糖含量测定的方法。结果表明，该方法简单，灵敏度高，显色稳定，重现性好，回收率高，结果准确，可为其继续研究开发及应用提供参考依据。苦丁茶冬青叶多糖的组成及生物活性有待于进一步研究。
       　　参考文献：
       ［1］  中国药材公司. 中国中药资源志要［M］.北京：科学出版社，1994： 689.
       ［2］  王  新，陆慧宁，林少琨. 苦丁茶冬青叶化学成分与药理作用研究进展［J］.天然产物研究与开发，2005，17（3）：366.
       ［3］  Tan Feng, Deng Jun. Analysis of the constituents and antisenile function of Achyranthes bidentata polysaccharides［J］.Acta Botanica Sinica, 2002, 44(7): 795.
       ［4］  Staub A M. Removal of proteins from polysaccharides［J］.Methods in Carbohydr Chem,1965,5:5.
       ［5］  刘定远. 医药数理统计方法，第3版［M］.北京：人民卫生出版社，1999：172.
       ［6］  董  群，郑丽伊，方积年. 改良的苯酚-硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究［J］.中国药学杂志，1996，31（9）：550.
       ［7］  崔红华，李超英，张大方，等. 用苯酚-硫酸法测定人参多糖含量的研究［J］.中国中医药信息杂志，1999，6（2）：24.
       ［8］  刘晓河，梁惠花，谭晓红. 茵陈中多糖的含量测定［J］.中草药，2003，34（6）：519.

　　(中山大学测试中心，广东 广州  510275；  辽宁大学制药工程系，辽宁 沈阳  110036)