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艾迪注射液抗肿瘤作用及其对免疫功能的增强效应研究
作者:潘耀振, 余黎, 李晓冬, 柏帅    
作者单位:1.贵阳医学院,贵州 贵阳 550004; 2.南京中医药大学, 江苏 南京 210029

《时珍国医国药》 2009年 第6期

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       【摘要】 
       目的研究艾迪注射液抗肿瘤作用及其对免疫功能的增强效应。方法利用小鼠体内移植瘤H22肝癌整体动物实验模型分析艾迪注射液的抑瘤率。采用双抗体夹心ELISA法检测荷瘤小鼠血清TNF-α和IL-6的水平;分析艾迪注射液对胸腺和脾脏指数的影响,以碳粒廓清法分析艾迪注射液对网状内皮系统吞噬能力。结果艾迪注射液对小鼠体内移植瘤H22肝癌的抑瘤率高达30%以上,显著提高胸腺和脾脏指数、提高血中TNF-α和IL-6的水平,增强内皮系统吞噬能力。结论艾迪注射液对小鼠体内移植瘤H22肝癌具有显著的抑制作用,其机制可能与改善免疫系统的能力相关。
       【关键词】  艾迪注射液 抗肿瘤 免疫功能
       Antitumor Activity and Immunoregulatory Effect of AiDi Injection
       PAN Yaozhen, YU Li, LI Xiaodong, BAI Shuai
       1.Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China; 2.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, China
       Abstract:ObjectiveTo investigate the antitumor activity and immunoregulatory effect of AiDi injection.MethodsInhibition rate (IR) on tumor growth and indexes of thymus and spleen were determined in mice with transplantable tumors of H22.The contents of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA in serum of mice with transplantable tumors of H22, and the carbon particle clearance was used to assay the phagocytic function of reticulo-endotheliial system. ResultsAiDi injection significantly increased the indexes of thymus and spleen, and enhanced contents of TNF-α and IL-6 in serum, elevated the phagocytic function of reticulo-endotheliial system,and its IR was over 30%.ConclusionAiDi injection shows potent antitumor effect in vivo. Promoting immunoactivity maybe one of the antitumor mechanism of AiDi injection.
       Key words:AiDi injection;  Antitumor;  Immunoactivity
       放、化疗在恶性肿瘤治疗中占重要的地位,但是在杀伤肿瘤细胞的同时,对正常细胞也有较强的杀伤作用,患者往往无法承受同时带来的骨髓、免疫、胃肠道等方面的不良反应,导致生存质量严重下降。近年来,从传统中医药宝库中寻找新的抗肿瘤药物或组方逐渐成为广大医药学科技工作者关注的问题[1]。艾迪注射液(简称艾迪)由人参、刺五加、黄芪和斑蝥等制备而成,具有扶正驱邪、抗肿瘤和免疫调节作用。该药物已经上市,并被广泛应用于临床,取得了较为满意的疗效。本文主要研究艾迪注射液对H22荷瘤小鼠抑制肿瘤的作用,同时研究其对荷瘤小鼠免疫功能的影响,为其临床应用提供实验基础与理论指导。
       1  材料与方法
       1.1 细胞株小鼠肝癌H22细胞株,购自上海中科院细胞研究所。
       1.2 样品及试剂艾迪注射液〔由贵州益佰制药有限公司提供,10 ml/只,0.301 5 g(生药)/ml,成人50~100 ml/次〕;1640培养基,Gibco公司提供,批号1177845;新生小牛血清,Hyclone 公司提供,DQAO 194。小鼠TNF-α,IL-6定量ELISA检测试剂盒,大连泛邦生物技术有限公司提供。
       1.3 动物健康昆明种小鼠,体重18~22 g,均由南京江宁县汤山青龙山动物繁殖厂提供,动物合格证号:SCXK(苏)2002-0027。
       1.4 对小鼠腋下接种H22肿瘤[2]取H22肿瘤细胞株用培养液制成细胞悬液,取少许的细胞悬液加等量的0.4%台朌蓝染液,显微镜下用血细胞计数板计数活细胞,计数后将悬液移入到25 ml培养瓶里,用含10%小牛血清的培养液按比例稀释至1×107/ml。再将培养瓶放入温度37℃,相对湿度100%,含5%CO2,95%空气的培养箱培养。给培养瓶内的细胞换液1次/d,2 d传代1次。传代2次,将培养液离心得到的肿瘤细胞,再稀释成浓度为1×107/ml的细胞后,用无菌注射器接种到小鼠腹腔内,0.2 ml/只。瘤株在动物体内传代2次后,选择接种8 d腹部明显膨大的动物,颈椎脱臼,固定于蜡板上,无菌操作,抽吸腹水,将6只动物的腹水混合。滴1滴腹水混合液于载玻片上,推片,瑞氏染色,镜下进行细胞分类记数,瘤细胞数>95%。腹水用无菌PBS液稀释至1×107个/ml,每鼠右腋下接种0.2 ml细胞。
       1.5 分组及给药肿瘤接种24 h后随机分组,即:正常对照组(等容积蒸馏水),模型组(等容积蒸馏水)、艾迪高剂量组(9.14 g/kg)、艾迪中剂量组(4.57 g/kg) 、艾迪低剂量组(2.29 g/kg);每组10只。尾静脉给药1次/d,给药容积为10 ml/kg,连续给药7 d。
       1.6 抑瘤率实验[3]末次给药后30 min球后静脉丛取血,处死小鼠,称体重并剥离皮下瘤块,称瘤重,计算瘤指数与抑瘤率。
       
       抑瘤率(%)=(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%
       瘤指数=瘤重(g)/动物体重(g)(实验结束时)
       1.7 荷瘤成年鼠免疫器官脏器指数分析处死动物,剖取胸腺和脾脏,按下式计算脏器指数:
       脏器指数(mg/g)= 脏器重量(mg)体重(g)×10
       1.8 IL-6及TNF-α分析对H22抑瘤率实验中取得血液,2 500 r/min离心15 min,分离制备血清。按检测试剂盒说明书进行检测操作,制备一系列标准溶液后,测定吸光度,与标准曲线对照,得到含量。
       1.9 对网状内皮系统吞噬活性的作用[4]末次给药后30 min ,尾静脉注射印度墨汁(用生理盐水稀释4倍)0.1 ml/10 g,注射后立即记时,于注射后3 min和13 min分别用肝素处理过的玻璃毛细管经小鼠球后静脉丛取血,取0.025 ml的血液加入含有0.1%Na2CO3 2 ml的试管中,混匀。于721分光光度计600 nm处测定每个样品的光密度值(OD),用0.1% Na2CO3液做空白对照。末次取血后,处死动物,取出肝脾称重,分别记录。
       
       计算清除速度的K值:K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)
       
       计算吞噬指数(α):α=(体重/肝重+脾重)× K。
       式中t2-t1 为两次取血时间间隔;α表示每克组织的吞噬活性。
       2 结果
       2.1 对H22荷瘤小鼠的影响实验结果提示,艾迪注射液高剂量组抑瘤率为47.5%,与模型组比较差异显著(P<0.01),并呈一定的量-效关系。结果见表1。表1  艾迪对小鼠H22的抑制作用(略)
       
       2.2 对免疫器官的影响艾迪注射液连续给药7 d,脾脏与胸腺系数明显增加,与模型组比较差异显著,提示艾迪对荷瘤小鼠的免疫功能可能有一定的增强作用。结果见表2。表2  对小鼠免疫器官脏器指数的影响(略)
       2.3 对免疫细胞因子的影响荷瘤小鼠IL-6和TNF-α的水平显著降低,与正常对照组比较差异显著,给予艾迪注射液后,使降低的细胞因子升高,高剂量组作用更加明显。结果见表3。表3  复方斑蝥浸膏对小鼠IL-6和TNF-α作用的影响(略)
       2.4 对网状内皮系统吞噬作用的影响荷瘤小鼠清除速度与吞噬指数明显低于正常对照组,差异显著;连续给予艾迪注射液7 d显著提高荷瘤小鼠的清除速度与吞噬指数,高剂量组与荷瘤模型组比较,差异显著,中低剂量组具有增加的趋势。提示艾迪注射液具有增强荷瘤小鼠网状内皮系统(RES)对吞噬功能的作用。结果见表4。表4  复方斑蝥浸膏对荷瘤小鼠的网状内皮系统吞噬活性影响(略)
       3 讨论
       
   
       多年来的动物实验和临床观察都表明,恶性肿瘤的发生、发展都伴随有机体免疫功能的降低,机体对抗肿瘤的免疫反应主要包括细胞免疫和体液免疫,两者相互配合[5]。目前认为在抗肿瘤细胞免疫机制中起主要作用的效应细胞包括T 淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等。胸腺是机体的中枢免疫器官,即免疫细胞产生、发育、分化、成熟的部位;脾是机体的外周淋巴器官,即成熟的淋巴细胞定居及对外来抗原发生免疫应答的场所。T 细胞是介导细胞免疫应答的主要免疫细胞,它在胸腺中发育成熟,同时也有辅助和增强体液免疫应答的功能,除此之外,T 细胞还有免疫调节功能,对维持机体内环境的稳定具有一定作用。异物进入体内血循环系统,可迅速为单核巨噬细胞吞噬而清除,其主要部位为肝脏和脾脏。测定血中异物的清除速度可反映网状内皮系统的吞噬功能。TNF-α和IL-6是由单核细胞分泌的重要的细胞因子[6]。TNF-α主要通过对肿瘤区域血管的影响引起移植肿瘤的出血坏死,TNF-α能直接作用于不同靶组织,杀伤肿瘤或诱导某些肿瘤细胞凋亡[7]。IL-6的抗肿瘤效应,主要通过调动机体免疫机制发挥抗肿瘤效应,也可直接或间接增强NK细胞及CTL的杀瘤活性。
       
       艾迪注射液是贵州益佰制药有限公司生产的临床广泛使用的抗肿瘤中药制剂,具有清热解毒、消瘀散结之功效,用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴瘤、妇科恶性肿瘤等。处方以斑蝥破血消癥,功毒蚀疮,引赤发泡为君药,发挥抗肿瘤的作用,以人参为臣药,辅助君药发挥抗肿瘤的作用以达到祛邪,同时扶助正气,刺五加、黄芪为佐使,辅助臣药,扶助正气,增强人体的抵抗力。
       
       本次实验研究结果提示,艾迪注射液对小鼠移植性H22实体瘤有显著的抑瘤作用,抑瘤率47.52%以上(抑瘤率实验重复3次,其中高剂量每次抑瘤率均超过30%,其余2次实验结果未在本文中列出)。荷瘤小鼠胸腺和脾脏的重量显著降低,而艾迪注射液可以显著提高荷瘤小鼠胸腺和脾脏的指数;荷瘤小鼠清除速度的K值和吞噬指数α显著降低,艾迪注射液的清除速度和吞噬指数明显高于模型组, 表明艾迪注射液能提高小鼠非特异性免疫网状内皮系统的吞噬功能,这对于清除或抑制肿瘤细胞可能产生有利的作用;荷瘤小鼠细胞产生TNF-α,IL-6的水平较正常小鼠显著下降,说明发生肿瘤时机体的免疫能力在下降,这可能是肿瘤免疫逃避抑制的一个因素。艾迪注射液能够促进荷瘤小鼠体内TNF-α,IL-6的分泌,从而提高机体免疫系统的抗肿瘤能力。
       
       综上所述, 艾迪注射液具有明显的抑制荷瘤机体肿瘤生长的作用, 其作用机制可能通过调节荷瘤机体异常的特异性与非特异性免疫状态而发挥抗肿瘤作用。其抗肿瘤作用机制及对肿瘤和免疫的其它影响, 有待进一步研究探讨。
       【参考文献】
           [1]黄晓峰, 周游. 益气败毒汤对S180荷瘤小鼠抑瘤作用的实验研究[J].黑龙江中医药,2008,1: 53.
       
       [2]韩悦.抗癌药物研究与实验技术[M].北京: 北京医科大学和中国协和医科大学联合出版社,1997:295.
       
       [3]梁丽坚.化积颗粒对S180肉瘤小鼠抑瘤作用的研究[J].时珍国医国药, 2007,18(4): 866.
       
       [4]张建峰,昌友权,陈 光,等.红曲多糖的免疫活性研究[J].食品科学,2008,29(2):391.
       
       [5]张秀娟,杨姗姗.半枝莲多糖体内抗肿瘤及其免疫调节作用的实验研究[J].亚太传统医药, 2008,4(2): 54.
       
       [6]Huang H, Pate DD, Manton KG. The immune system in aging: roles of cytokines, T cell and NK cells[J].Front Biosci, 2005,10: 192.
       
       [7]古萃萍, 张沂平. TNF-α抗肿瘤作用机制新进展[J].中国肿瘤, 2007,16(2): 102.

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