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       【摘要】 
       目的研究重楼皂苷对SGC-7901人低分化胃腺癌细胞的作用及影响机制。方法在体外应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法观察重楼皂苷对细胞生长的抑制作用；应用Fluo-3／AM 荧光标记技术和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测不同药物浓度处理的SGC-7901人低分化胃腺癌细胞［Ca2+］i 的变化。结果重楼皂苷可显著抑制肿瘤细胞的增殖作用；重楼皂苷作用24h后能引发SGC-7901细胞［Ca2+］i的明显增加。结论重楼皂苷可能通过增加细胞内［Ca2+］i诱导细胞凋亡，从而发挥其抗SGC-7901细胞增殖的作用。
       【关键词】  重楼 皂苷 激光扫描共聚焦显微镜 凋亡
       重楼又名“七叶一枝花”，为植物根茎，是云南白药的主要组成成分，具有止血、免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等广泛药理作用，其具生物活性的主要成分是多种甾体皂苷。目前，中药重楼及其复方抗肿瘤作用机制多集中在细胞毒和调节机体免疫功能等方面［1，2］。本研究的目的在于探讨重楼皂苷是否通过诱导细胞凋亡这一途径而发挥其抑制肿瘤细胞增殖的作用。
       1  材料与仪器
       1.1  药品与试剂
       重楼皂苷（天津市中药饮片厂）；Fluo-3/AM （sigma公司）。
       1.2 仪器
       ALISEI随机型全自动酶标板分析仪（意大利RAPIM集团）；低温超速立式离心机 （Tomy Seiko Co.Ltd,MRX-150型）；激光扫描共聚焦显微镜（美国伯乐公司，Bio-rad Radiance 2000）。
       2 方法
       2.1  MTT法测定
       重楼皂苷对肿瘤细胞生长的抑制实验［3］将浓度为5×104 /ml的SGC-7901细胞悬液接种于96孔板中，培养24h后，加入重楼皂苷药液使其终浓度分别为5，10，20，40，80μg/ml，同时设阴性对照组、顺铂阳性对照组，每组5个平行孔， 37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24，48，72 h后，离心弃上清液，加入MTT继续培养4 h，离心弃上清液后加入盐酸异丙醇振荡10 min，应用酶标仪于490 nm处测吸光度值（A）。按公式计算细胞生长抑制率。实验重复3次。生长抑制率（%）=(对照组OD值－用药组OD值)/对照组OD值×100%。
       2.2 激光共聚焦观察重楼皂苷对SGC-7901细胞内［Ca2＋］i的影响［4］
       2.2.1 SGC－7901细胞株的处理
       分别设不同浓度重楼皂苷药物组与阴性对照组，SGC-7901细胞以3×106/ml接种于六孔板中的载玻片上，培养24 h后，加入重楼皂苷药液使其终浓度分别为5，10，20，40 μg/ml，和不加药液的细胞培养基作为对照组，继续培养24 h后，用PBS液漂洗细胞。将载玻片放入Petri皿中，加入10 μmol/L Flu－3／AM应用液，37℃下孵育细胞约40 min，用PBS液洗脱细胞外未结合的荧光，再于37℃下保温约10 min， LSCM下观察。
       2.2.2 LSCM动态观察
       重楼皂苷对SGC-7901细胞内［Ca2＋］i的变化［5］LSCM观察负载Fluo-3／AM的SGC-7901细胞未给药时细胞内荧光强度，即［Ca2＋］i水平，时间300S；弃上清液，加入重楼皂苷终浓度为10 μg/ml的药液，孵箱内孵育10 min后，上机观察SGC－7901细胞内［Ca2＋］i变化，观察时间300S；同法操作，观察药物浓度为20，40 μg/ml时对细胞内［Ca2＋］i的影响。
       2.2.3  LSCM静态观察
       重楼皂苷处理24h后SGC-7901细胞内［Ca2＋］i的变化LSCM观察负载Fluo-3／AM的SGC-7901细胞给药及未给药时细胞内的荧光强度，即［Ca2＋］i水平，激发波长为488 nm，检测波长为530 nm，每组随机取5个视野，计算细胞总数及总荧光强度（FI）值，取其平均值代表平均细胞内［Ca2＋］i。
       2.3 统计学处理
       采用SPSS13.0统计软件进行处理，实验数据以±s表示，实验结果采用t检验。
       3 结果
       3.1 重楼皂苷对SGC-7901细胞生长增殖的抑制作用
       重楼皂苷对SGC-7901肿瘤细胞具有明显的生长抑制作用，且呈剂量、时间依赖关系。结果见表1。表1  重楼皂苷对体外培养的SGC-7901细胞的抑制作用（略）
       3.2 LSCM观察肿瘤细胞内钙离子强度的变化
       LSCM动态观察［Ca2＋］i浓度的变化，对照组及重楼皂苷处理组细胞内［Ca2＋］i浓度随扫描时间的延长均有缓慢上升趋势；但在同一扫描时段，药物处理后细胞内［Ca2＋］i浓度与对照组比较没有统计学意义，即不同浓度的重楼皂苷对细胞内钙离子的动态变化没有影响。结果见表2。表2  重楼皂苷对SGC－7901细胞［Ca2＋］i作用的动态变化（略）表3  重楼皂苷处理24h后SGC-7901细胞内［Ca2＋］i的静态变化（略）
       4 讨论
       重楼为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎。本品味苦，微寒，有小毒，归肝经；具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊等功效，用于治疗疔疮痈肿，咽喉肿痛，毒蛇咬伤，跌打伤痛，惊风抽搐。现代药理研究发现本品提取物具有止血、抗炎、镇静镇痛、抗肿瘤和抗癌等作用［6］。重楼主要化学成分为甾体皂苷，约占总化合物数目的80％，其皂苷元多为薯蓣皂苷元(Dipsgenin)，次为偏诺皂苷元(Pennogenin)，并含有氨基酸、甾酮、蜕皮激素、黄酮苷等化合物，其中重楼皂苷为其抗肿瘤有效成分。
       本研究中重楼皂苷对人低分化胃腺癌SGC－7901细胞增殖具有抑制作用且其作用呈时间、剂量依赖性关系。目前有关中药重楼抗肿瘤作用机制的研究尚少，其研究多集中在细胞毒作用和调节机体免疫功能方面，对其诱导细胞凋亡的作用机理还缺乏系统了解，故本实验从分子水平对其诱导肿瘤细胞凋亡的机理作进一步的探讨。
       钙离子是机体的重要元素，细胞的许多生理代谢活动都有钙离子的参与，它在细胞的生命活动中担当着重要的角色。早期研究者认为凋亡过程中胞浆内的 Ca2+ 浓度升高是凋亡的结果之一。郭静等［7］在多种细胞模型中对各种凋亡刺激剂的检测结果表明 Ca2+浓度的升高在凋亡早期就已经发生，Ca2+可能是主动调控凋亡起始的因素之一。本实验应用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）与荧光标记技术观察重楼皂苷处理后的SGC-7901细胞内钙离子浓度的动态变化以及处理24 h后细胞内钙离子的荧光强度的变化，发现加入重楼皂苷后LSCM连续扫描300 s, ［Ca2＋］i的荧光强度与未加药前比较没有显著变化，此时药物对细胞内钙离子浓度无明显影响，考虑与重楼皂苷分子量较大，短时间内很难通过细胞膜进入细胞而发挥其作用有关；而药物处理细胞24 h后，SGC-7901细胞内钙离子荧光强度较阴性对照组明显增强，且有随着药物浓度的增加呈增强的趋势，提示重楼皂苷可能通过升高细胞内钙离子水平诱导细胞凋亡，从而起抑制肿瘤细胞增殖的作用。
       综上所述，本实验在肯定重楼皂苷能抑制SGC-7901细胞增殖的同时，采用LSCM测定细胞内钙离子浓度的变化提示重楼皂苷作用后可能通过诱导SGC-7901细胞凋亡来发挥其抑制细胞增殖的作用，这为进一步研究重楼皂苷对其他肿瘤细胞的增殖抑制作用提供了一定的理论基础。但由于目前仅在体外对重楼皂苷诱导SGC-7901细胞凋亡进行了研究，至于其在体内对细胞凋亡的影响尚未清楚；另外有关其抗肿瘤的详细生化机制还有待进一步阐明。
       【参考文献】
         　　［1］金炜东,陈孝平，蔡红娇，等.重楼提取物对HepG2细胞的毒性作用［J］.华中科技大学学报（医学版）,2006，35(1):103.
       
       ［2］许玲,刘嘉湘.益肺抗瘤饮对肺癌转移及免疫功能的影响［J］.中国中西医结合杂志,1997,17(7):401.
       
       ［3］边洪荣，李小娜，王会敏.重楼的研究及应用进展［J］.中药材，2002，25（3）：218.
       
       ［4］姜泊.细胞凋亡基础与临床,第1版［M］.北京：北京军事出版社，1999：89.
       
       ［5］袁兰.激光扫描共聚焦显微镜技术教程［M］.北京：北京大学医学出版社，2004：75.
       
       ［6］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：183.
       
       ［7］郭静，蒲咏梅，张东才，等.钙离子信号与细胞凋亡［J］.生物物理学报，2005，21(1):1.