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       【摘要】 
       目的建立测定不同产地卷柏中阿曼托双黄酮含量的高效液相色谱法。方法色谱柱为Agilent ZORBOX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.2%磷酸(40∶60)，柱温30 ℃；流速为0.8 ml·min-1；检测波长337 nm。结果阿曼托双黄酮含量为1.197%，平均回收率为99.30%，RSD=0.98%(n = 9)，线性范围0.1～0.6 μg·ml-1(r=0.999 8)。 结论该法快捷、灵敏、准确，可作为评价卷柏药材质量的参考依据。
       【关键词】  卷柏 阿曼托双黄酮 高效液相色谱法
       卷柏为卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina (Beauv.) Sping或垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook. et Grev.) Maxim) 的干燥全草，具有活血通经功效，主要用于经闭痛经、癥瘕痞块、跌扑损伤、崩漏、便血、脱肛等［1］病症。根据文献报道［2～4］，卷柏中主要含有阿曼托双黄酮、新柳杉双黄酮等化合物，具有抗脂质过氧化和清除自由基的作用［5］，对溶血性磷脂酰胆碱(LPC)诱导的血管内皮细胞损伤有保护作用［6］，其中阿曼托双黄酮的含量最大。采用反相高效液相法对卷柏药材指纹图谱研究的报道已见，但未见不同产地卷柏药材中阿曼托双黄酮含量测定的报道。本研究采用高效液相色谱法测定了全国10批不同产地卷柏中阿曼托双黄酮的含量。 
       1  仪器与试药
       1.1  仪器
       岛津UV-2201型紫外分光光度计；Shimadzu LC-10AT型高效液相色谱仪；SPD-10A型紫外检测器；AB204-N万分之一电子天平；AE240十万分之一电子天平；DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司），旋转蒸发器SB-1000(上海爱朗仪器有限公司)。
       1.2 试药 
       卷柏药材产地分别为安徽、北京、河南、新疆、山东、云南、湖北、河北、江西、甘肃，共收集10批样品，经过河南中医院药学院生药学科陈随清教授鉴定为卷柏科卷柏属卷柏Sela- ginella tamariscina (Beauv.) Sping的全草。阿曼托双黄酮为本实验室自制，纯度达到99%以上。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件及系统适应性实验
       色谱柱为Agilent ZORBOX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相为乙腈-0.2%磷酸（40∶60）。流速0.8 ml·min-1；检测波长337 nm；柱温30 ℃；进样量10 μl。    
        测定阿曼托双黄酮对照品溶液和卷柏药材供试品溶液，色谱图见图1。如图1所示，阿曼托双黄酮与相邻杂质峰的分离度大于2，理论塔板数按阿曼托双黄酮峰计算大于3 000。
       2.2 对照品溶液的制备
        
       精密称取干燥恒重的对照品2.50 mg，置50 ml容量瓶中，加95%乙醇超声溶解，定容至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，作为对照品溶液（50 μg·ml-1）。
       2.3 供试品溶液的制备
       精密称取卷柏药材（过3 号筛）粉末约4.00 g，置100 ml圆底烧瓶中，精密加入95％乙醇40 ml，85 ℃回流2 次，2 h/次，提取液回收溶剂，真空干燥。精密称取干燥恒重的乙醇提取物约3.00 mg，置100 ml容量瓶中加95%乙醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。 
       2.4 线性关系考察 
       精密吸取对照品溶液 0，2，4，6，8，10，12 μl依次进样，按上述色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，得回归方程为：Y = 2 346 639 X +6 411.314（r=0.999 8）。结果表明阿曼托双黄酮在(0.1～0.6) μg·ml-1浓度范围内线性关系良好。 
       2.5 精密度实验　
       精密吸取50 μg·ml-1对照品溶液，重复进样6 次，10 μl/次，测定峰面积值，计算相对标准差，结果RSD=0.92%，显示精密度良好。
       2.6 重复性实验
       精密称取同一样品（产地：河南）适量，照“2.3”方法分别制备供试品溶液6份，照“2.1”法进行测定，结果平均含量为1.19% ，RSD=0.13%，表明本测定方法的重复性良好。
       2.7 稳定性实验　
       取同一样品(产地：河南) 适量，照“2.3”方法制备供试品溶液，室温下放置0，2，4，6，8，12，24，48 h进样10 μl，依法测定阿曼托双黄酮的峰面积值，计算相对标准偏差，RSD为0.35%。结果表明，供试品溶液室温下48 h内稳定。
       2.8 加样回收率实验
       照“2.3”方法制备供试品（产地：河南）乙醇提取物，精密称取已知含量的卷柏乙醇提取物样品9份，每份约3.00 mg，分为3 组，每组中分别加入精密称定的阿曼托双黄酮0.10，0.20，0.30 mg，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法配制回收率供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果见表1。结果表明，阿曼托双黄酮回收率实验良好。 表1  阿曼托双黄酮回收率实验（略）
       2.9 样品含量测定
       分别精密称取10批不同产地卷柏药材粉末各4.0 g，按“2.3”项方法制备供试品溶液，照“2.1”方法测定，平均含量为0.780%。结果见表2。
       3 讨论
       3.1 提取方法的选择
       在制备样品溶液时，比较水煮、超声、回流等不同提取方法，发现回流提取方法得到的阿曼托双黄酮的含量较高，故采用回流提取的方法对样品进行处理。
       3.2 测定波长的选择
       取阿曼托双黄酮对照品加流动相在190～800 nm波长范围内测定吸收光谱，结果对照品阿曼托双黄酮溶液在270 nm和337 nm处均有较大吸收，由于270 nm靠近溶剂末端吸收，容易对样品测定造成干扰，故选337 nm为测定波长。表2  样品含量测定结果（略）
       3.3 流动相的选择
       在测定阿曼托双黄酮含量时，参考文献［7］的方法，虽然对照品出峰时间短，但样品峰的分离不好，个别样品在阿曼托双黄酮保留时间处有吸收干扰，为了避免此现象出现，根据阿曼托双黄酮为弱酸性化合物的性质，在选择流动相时用0.2%磷酸作为无机相，通过比较甲醇和乙腈的出峰效果，最终选择乙腈作为有机相，使峰的分离度大大提高。
       
       在加样回收率考察中，选择高、中、低3个剂量组，结果平均回收率均达到98%以上，RSD均小于1.5，说明此方法可用于卷柏的质量控制。
       
       测定了10批不同产地卷柏药材中阿曼托双黄酮的含量，结果平均含量为0.780%，最低为安徽产只有0.225%，最高为山东产含量为1.197%，不同产地卷柏药材中阿曼托双黄酮的含量有差异，说明卷柏中阿曼托双黄酮的含量受地质环境、气候的影响，这为环境因素与药材有效成分含量之间的相关性研究奠定了良好的基础。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会．中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：157．
       
       ［2］毕跃峰，郑晓珂，冯卫生，等．卷柏属植物化学成分与药理活性［J］.国外医药·植物药分册，2002，17（3）：97.
       
       ［3］毕跃峰，郑晓珂，冯卫生．卷柏中化学成分的分离与结构鉴定［J］.药学学报，2004，39（1）：41.
       
       ［4］郑晓珂，毕跃峰，冯卫生，等.卷柏中化学成分［J］.药学学报，2004，39（14）：266.
       
       ［5］熊国强，雷荣昌．析因设计在腭裂修复动物实验中的应用［J］.中国现代医学杂志，2002，12(16)：18.
       
       ［6］徐智，贾素洁，谭桂山，等．垫状卷柏中双黄酮药理活性的研究［J］.中国现代医学杂志，2004，14(14)：88.
       
       ［7］刘海青，林瑞超，冯 芳，等．HPLC法测定卷柏类药材中双黄酮成分的含量［J］.药物分析杂志，2002，22(5)：393.