文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的建立高效液相色谱法（HPLC）测定贯叶连翘提取物中金丝桃素、金丝桃苷、芦丁和槲皮素含量的方法。方法色谱柱为C18柱 ( 250 mm×4.6 mm，5 μm)；测定金丝桃苷、芦丁和槲皮素时,流动相为甲醇-乙睛-0.3%磷酸溶液，梯度洗脱，检测波长360 nm；测定金丝桃素时，流动相为甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液，检测波长580 nm。结果金丝桃苷，槲皮素，芦丁、金丝桃素线性范围分别为1.97～20.3 μg·ml-1 (r=0.999 2)，2.47～24.7 μg·ml-1(r=0.999 1)，2.25～22.5 μg·ml-1(r=0.999 1) , 0. 08～0.4 μg·ml-1(r=0.999 5), 方法回收率均不低于98%。结论该方法简便、准确、重复性好，可用作贯叶连翘提取物中此4种成分的含量测定。
       【关键词】  贯叶连翘提取物 金丝桃素 金丝桃苷 高效液相色谱法
       Determination of Four Components in the Hypericum perforatum L. Extracts by HPLC
       XU Xiaohong, LIAO Liyun, CHEN Longjiang
       Department of Pharmacology, Chengdu Medical College, Chengdu, Sichuan, 610083,China
       Abstract：ObjectiveTo develop a rapid high-performance liquid chromatography method for determination of hypericin, hyperoside, rutin and quercetin in Hypericum perforatum L. extracts.MethodsHPLC method was employed on C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The hyperoside, rutin and quercetin were detected at 360 nm, eluted with gradient three mobile phase (methanol-acetonitrile-0.3% phosophoric acid). The Hypericin was detected at 580 nm and the mobile phase consisted of methanol and 0.02 mol·L-1 KH2PO4.Results The HPLC method showed a good linear relationship in the range of 1.97～20.3 μg/ml (r=0.999 2) for hyperoside, 2.47～24.7 μg/ml (r=0.999 1) for quercetin, 2.25～22.5 μg·ml-1 (r=0.999 1) for rutin and 0.08～0.4 μg/ml　(r=0.999 5) for hyperin. Recoveries for the four components were all above 98%.CondusionThis HPLC method is simple, accurate and repeatable and can be used for determination of the four components in Hypericum perforatum L. exatracts.
       Key words：Hypericum perforatum L. extracts;  Hyperin;  Hyperoside;  HPLC
       贯叶连翘Hypericum performatum L.为藤黄科金丝桃属多年生草本植物，其味苦、辛，性平，可清心明目、调经活血、止血生肌、解毒消炎［1］，国外在抗抑郁症方面也有广泛应用［2］。贯叶连翘其提取物主要成分有金丝桃素 (hypericin)、金丝桃苷、芦丁和槲皮素等，结构式如图1。其中金丝桃素为萘骈二蒽酮类结构，在酸性溶液中溶解度极低；其余3种物质为黄酮类结构，采用HPLC测定含量时一般需偏酸性流动相，因此较难用同种方法同时测定此4种物质。金丝桃苷与芦丁均为槲皮素与不同糖苷形成的苷，采用等度HPLC分离度较难达到要求。因此本文分别建立了金丝桃素HPLC测定法与金丝桃苷、芦丁和槲皮素HPLC梯度洗脱测定法，以期为贯叶连翘提取物的质量控制及制剂的开发提供含量测定的方法。
       1  仪器与试药
       1.1 仪器
       高效液相色谱仪（Dionex,美国），包括P680四元泵、ASI-100自动进样器、UV1700型检测器，TC100柱温箱，Chromeleon工作站，PHS-3C型酸度计（上海精密科学仪器有限公司）。
       1.2 试药金丝桃素对照品(Sigma 公司，规格1mg, 批号548-04-9)；金丝桃苷对照品（批号111521-200303），槲皮素对照品(批号100081-200406)，芦丁对照品(批号100080-200306)，均购自中国生物制品检定所。贯叶连翘提取物, 成都医学院天然药化教研室制备。甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸二氢钾、磷酸为分析纯，水为纯蒸水。
       2 方法与结果
       2.1  金丝桃素测定
       2.1.1  色谱条件色谱柱Alltech C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(2∶98) (取1.36 g磷酸二氢钾，加水500 ml使溶解，用四丁基氢氧化铵溶液调pH值至6.5)；检测波长580 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温40 ℃；进样量20 μl。理论塔板数以金丝桃素峰计不得低于3 000。结果见图2。
       2.1.2  对照品贮备液的制备取金丝桃素对照品1 mg，置50 ml棕色量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀制得浓度为20 μg·ml-1的对照品贮备液。
       2.1.3  供试品溶液的制备取贯叶连翘提取物粉末50 mg，置25 ml量瓶中，加入适量甲醇，超声处理30 min，加甲醇定容至刻度，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
       2.1.4  线性范围考察精密吸取“2.1.2”项下金丝桃素对照品贮备液，依次制备浓度为0.40，0.32,0.24,0.20, 0.16, 0.08 μg·ml-1的系列标准品溶液，分别取20 μl,注入色谱仪，记录金丝桃素峰面积，以峰面积值(A)为纵坐标，浓度C (μg·ml-1)为横坐标，进行线性回归，结果方程为：A=572.73C-0.212，r=0.999 5，表明金丝桃素在0.08～0.40 μg·ml-1范围内线性关系良好。
       2.1.5  稳定性实验取置棕色量瓶中放置的供试品溶液20 μl, 分别于0，1，2，3，4 h注入色谱仪，测定金丝桃素峰面积的RSD为1.65% (n=6) ，表明供试品溶液在4 h内基本稳定。
       2.1.6  重复性实验取同批样品约50 mg, 精密称定, 共5份, 制备供试品溶液,精密吸取20 μl,注入液相色谱仪,测定峰面积, 金丝桃素含量为1.21 mg·g-1，RSD为1. 4%(n=5) 。本方法的重复性良好。
       2.1.7  加样回收率实验取金丝桃素含量已知的提取物样品5份, 每份约50 mg, 精密称定,分别精密加入金丝桃素对照品贮备液1 ml, 按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进样20 μl，计算回收率。结果见表1。表1  金丝桃素回收率实验（略）
       2.2 金丝桃苷、槲皮素、芦丁的测定
       2.2.1 色谱条件色谱柱Alltech C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为磷酸(0.3%),流动相B为乙腈，流动相C为甲醇；采用梯度洗脱法：0 ～10 min  (95～85∶5～15∶0), 10 ～ 30 min (85～70∶20～75∶0～10), 30 ～45 min (70～10∶20～75∶10～15), 45～55 min (10～5∶75～80∶15), 55～56 min (5～95∶80～5∶15～0), 56～60 min (95∶5∶0) ；检测波长360 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温40℃；进样量20 μl。理论塔板数以金丝桃苷峰计不得低于5 000。结果见图3。
       2.2.2 对照品溶液的制备分别精密称取金丝桃苷、槲皮素、芦丁对照品12.5，10.30, 7.02 mg, 分别置50 ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，待用。依次取以上3种对照品溶液2.0，3.0 ，4.0 ml至25 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得分别含金丝桃苷、槲皮素、芦丁20.0，24.7，22.4 μg·ml-1的混合对照品溶液。
       2.2.3 供试品溶液的制备同“2.1.3”项下方法。
       2.2.4 线性范围考察精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液，稀释制备成系列浓度的混合标准品溶液，分别取20 μl注入色谱仪，记录金丝桃苷、槲皮素、芦丁峰面积，以峰面积值A为纵坐标，浓度C(μg·ml-1)为横坐标进行线性回归，方程及回归系数分别为：金丝桃苷：A=0.583 5C-0.503 2，r=0.999 2(n=6)；槲皮素:A=1.530 6C-1.696 3,r=0.999 1；芦丁：A=0.490 6C-0.365 2,r=0.999 1。表明3种成分分别在1.97～20.3 μg·ml-1，2.47～24.7 μg·ml-1，2.25～22.5 μg·ml-1范围内线性良好。
       2.2.5 稳定性实验取置棕色量瓶中放置的供试品溶液20 μl, 于0，1，2，3，4 h分别注入液相色谱仪，测定金丝桃苷、槲皮素、芦丁峰面积的RSD分别为1.88%,1.27%, 1.45% (n=5) 。　表明提取物供试品溶液中3种成分在4 h基本内稳定。
       2.2.6 重复性实验取同批样品约50 mg, 精密称定, 共5份, 制备供试品溶液,精密吸取20 μl,注入液相色谱仪, 测定金丝桃苷、槲皮素、芦丁峰含量分别为6.72，13.52，5.88 mg·g-1,RSD分别为1.67%, 1.53%, 1.48% (n=5)。
       2.2.7 回收率实验采用加样回收法,称取已知金丝桃苷、槲皮素、芦丁含量的提取物样品5份,每份约50 mg,精密称定,分别精密加入混合对照品溶液2.0 ml, 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液, 进样20 μl,计算回收率。结果见表2。表2  金丝桃苷、芦丁、槲皮素回收率实验结果（略）
       2.3 样品测定取连续3批提取物, 依法制备供试品溶液, 分别按上述色谱条件测定4种成分。结果见表3。表3  3批贯叶连翘提取物含量测定结果（略）
       3 讨论
       金丝桃素仅溶于偏碱性水溶液中，在酸性流动相环境中不出峰，很难与其它3种成分同时测定，本实验调节流动相pH值为6.5时,金丝桃素峰峰形良好，适于该物质含量测定。
       
       测定金丝桃苷、芦丁和槲皮素时，在270 nm及360 nm波长处均有较强吸收，但在360 nm波长处杂质峰较少，分离效果好。金丝桃苷与芦丁为槲皮素与不同糖苷形成的苷，理化性质差异较小，等度HPLC分离度难以达到要求，本文采用梯度洗脱的方法，可完全分离金丝桃苷、芦丁，分离度>2.0。
       【参考文献】
         　　［1］胡然，库宝善，张永鹤．人类免疫缺陷病毒与疱疹病毒感染具有相关性［J］．生理科学进展，2004,35(1)：63．
       
       ［2］杨得坡，甘良春，胡海燕．国外对贯叶连翘抗抑郁疗效的临床验证［J］．中西医结合学报，2004,2(3)：231．