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       【摘要】 
       目的分析测定秦巴山区产细辛Aristolochia sieboldii Miq.和汉中防己A. heterophylla Hemsl.两种药材中马兜铃酸A的含量。方法色谱柱：Agilent ODS (5 μm, 4.6 mm×250 mm);流动相：甲醇-乙腈-1%冰乙酸（47∶17∶36）;流速1.0 ml/min；柱温∶室温；检测波长315 nm。结果细辛中马兜铃酸A的平均含量为74.1 μg/g，汉中防己中马兜铃酸A的平均含量为2.14 mg/g。结论汉中防己中的马兜铃酸A含量是细辛中马兜铃酸A含量的30倍左右。
       【关键词】  细辛 汉中防己 马兜铃酸A 高效液相色谱法
       细辛为马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var. mandshuricum（Maxim.）Kitag.，华细辛A.sieboldii Miq.的干燥全草，主要分布于辽宁、吉林、黑龙江、陕西、山东等省。临床上用于祛风散寒，通窍止痛，温肺化饮［1］ 。汉中防己为马兜铃科马兜铃属异叶马兜铃 Aristolochia  heterophylla  Hemsl.的干燥根，生于山坡灌丛中，主产于陕西。原植物为缠绕藤本，高2～3 m，根圆柱形，长8～15 cm，直径2～5 cm，有香气，外皮黄棕色或灰褐色。性寒，味苦，能祛风，利湿，镇痛，用于水肿、小便不利、风湿痹痛等症。
       
       近年来，马兜铃科植物体含有的马兜铃酸引起肾脏损害的临床报道和毒理研究受到广泛重视，许多研究报告对一些常用的含马兜铃酸药材进行了分析 ［2～7］ ，为这些药材的临床使用提供科学依据。由于植物体内的化学成分含量与生长环境有密切的关系，不同产地的同一种药材化学成分存在一定的差异，在现有的报道中，不同产地的细辛所含马兜铃酸A的量差异也较大［8～15］ 。秦巴山区有丰富的药用植物资源，但含马兜铃酸药材的分析研究还较少。本文选用产于秦巴山区的两种含马兜铃酸的常用药材细辛和汉中防己，分析其药用部位马兜铃酸的含量，为药用资源的开发利用以及常用药材的安全使用提供科学依据。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器
       紫外分光光度计（TU-1221），高效液相色谱仪（Agilent 1200）,微型植物试样粉碎机（FZ102），电子天平，索氏提取仪，三用电热恒温水箱。
       1.2 材料
       本实验所用实验材料华细辛（原植物为华细辛A.sieboldii Miq.全草）和汉中防己（原植物为异叶马兜铃A. heterophylla Hemsl.干燥根）产自陕西汉中，均由陕西省汉中市药品检验所提供。
       1.3 试剂
       马兜铃酸A对照品购自中国药品生物制品鉴定所（批号：110746-200406）；乙腈为色谱纯，甲醇，分析纯，西安化学试剂厂；乙醚，分析纯，天津市化学试剂六厂；水为纯化水；3.6%硫酸溶液；0.5%氢氧化钠溶液。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件
       高效液相色谱仪（Agilent 1200）；色谱柱：Agilent ODS（5 μm,4.6 mm×250 mm,Agilent）；流动相：甲醇-乙腈-1%冰乙酸（47∶17∶36）；流速1.0 ml/min；柱温：室温；检测波长315 nm。进样量：20 μl，保留时间：12 min。
       2.2 实验材料准备
       用微型植物试样粉碎机分别粉碎细辛和汉中防己两种药材，按照《中国药典》操作，药材粉末过40目筛，盛于洁净干燥的广口瓶中备用。
       2.3 对照品溶液的制备
       用电子天平精密称取马兜铃酸A标准品7.5 mg，用甲醇定容至 25 ml的容量瓶中（C=0.3 mg/ml）。摇匀，再精密吸取0.5 ml置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，使其成为15 μg/ml的溶液，放于4℃冰箱储存备用。
       2.4 供试品溶液的制备
       用电子天平精密称取汉中防己药材粉末1 g，置于150 ml索氏提取仪中，加入适量的甲醇，加热回流5h。将提取液回收至干，用15 ml 0.5%NaOH溶液，使其完全溶解，转至分液漏斗中，调pH=10，用乙醚萃取两次，15 ml/次。萃取后的碱液，用3.6%的硫酸溶液调pH=2，再用乙醚萃取4次，15 ml/次，合并萃取液，水浴蒸干，用甲醇定容于150 ml容量瓶中备用。
       
       用电子天平精密取细辛药材粉末5 g，置于150 ml索氏提取仪中，用上述方法进行提取，纯化后用甲醇定容至50 ml容量瓶中备用。
       2.5 检测波长的测定 
       取马兜铃酸A标准品储备液，在200～400 nm波长范围内扫描，在390，315 nm处有最大吸收峰。高效液相色谱实验结果表明，在315 nm处干扰弱，灵敏度高，因此选择315 nm作为检测波长。
       2.6 线性关系的考察 
       分别吸取浓度为15 μg/ml的马兜铃酸A标准品溶液5，10，15，20，25 μl进入高效液相色谱仪中进行分析。以进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得标准曲线回归方程为Y=28.804X-1.12，相关系数r=0.999 958，表明马兜铃酸A 在0.075～0.375 μg范围内进样量和峰面积值呈现良好的线性关系。见图1。
       2.7 精密度实验 
       精密吸取浓度为15 μg/ml的马兜铃酸A标准品储备液20 μl，注入高效液相色谱仪中分析。连续进样5次，计算峰面积的RSD值为0.6%。
       2.8 稳定性实验 
       取细辛和汉中防己的均匀供试品溶液各一份，室温放置，于0，2，4，6，8，10 h进样20 ml测定，样品在10 h内稳定。细辛和汉中防己供试品溶液的峰面积的RSD值分别为2.0%和0.28%。
       2.9 重复性实验
       取同一批细辛和汉中防己药材，按供试品溶液的制备方法平行制备5份供试品溶液，进样20ml测定。计算其马兜铃酸A含量的RSD值分别为0.8％和3.7％。                                     
       2.10  回收率实验 
       采用加样回收率法，精密吸取质 量浓度已知的马兜铃酸A样品及细辛、汉中防己供试液，将其等体积混合，然后注入高效液相色谱仪中分析，重复做5次，进行回收率测定。结果显示，细辛的平均回收率为100.6%，RSD值为1.1％；汉中防己的平均回收率为99.6%，RSD值为1.81％。
       2.11 样品的测定
       分别称取细辛5 g和汉中防己1 g，按“2.4”方法制备供试品溶液，与对照品同样色谱条件下测定。色谱图见图2～4。
       2.1.2 药材中马兜铃酸A的含量
       经检测实验结果为：细辛中马兜铃酸A的平均含量为 74.1 μg/g，汉中防己中马兜铃酸A的平均含量为2.14 mg/g。结果见表1。表1  细辛和汉中防己中马兜铃酸A的含量（略）
       在现有文献中，不同产地细辛中马兜铃酸A的含量变化较大。姜旭等［7］报道其含量范围在0～351 μg/g之间，其中华细辛平均含量为145 μg/g。在李琳等［2］的报道中，华细辛中的马兜铃酸A含量为0.178％。相比之下，本实验检测的产于秦巴山区的华细辛马兜铃酸A含量较低。
       分析结果同时表明，产于秦巴山区的汉中防己中马兜铃酸A含量较高，其含量是华细辛中马兜铃酸A含量的30倍左右。
       3 讨论
       3.1 实验方法对含量测定的影响
       细辛药材中只含有微量马兜铃酸A，必须采用灵敏度高的方法才能检测到。文献中曾采用薄层色谱法，没有检测到马兜铃酸A，可能是由于灵敏度较低的缘故。为了提高灵敏度，采用吸光度较高的波长是有利的，马兜铃酸A在紫外区的两个吸收峰，以390 nm为最灵敏，但是却存在较大的干扰，本实验兼顾灵敏度和专属性，选用315 nm为检测波长。
       3.2 供试样品制备法对含量测定的影响
       在制备细辛和汉中防己供试样品提取液时，由于药材中含有木兰碱、马兜铃内酰胺、青木香酸等多种杂质，会干扰实验结果，因此，我们根据马兜铃酸A可溶于碱的原理，在碱液中用乙醚萃取除去杂质后，分离效果较好。碱化时碱性要达到pH=10，否则马兜铃酸A不能完全溶解，酸化时酸性要达到pH=2，否则马兜铃酸A不能完全析出，萃取不完全。
       【参考文献】
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