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       【摘要】 
       目的以恩施州道地药材——五鹤续断为原料，初步研究其多糖提取分离及其动态分布规律。方法采用石油醚脱脂、热水浸提、乙醇沉淀分离、sevage脱蛋白、冷冻干燥等方法提取分离续断多糖，并采用蒽酮比色法测定续断多糖的含量，了解其多糖的动态分布规律。结果在提取2次、加料液比为1∶20、提取时间2 h、提取温度为95 ℃时，续断多糖得率最高，三年生续断根多糖分布最高。结论五鹤续断多糖分布规律为：三年生根＞两年生根＞一年生根＞叶，人工种植的续断根＞野生根。
       【关键词】  五鹤续断 多糖 提取分离 分布规律
       Studies on Extraction and Separation Procedure of Polysaccharides in Wu-He Dipsacus asper
       WU Yun，DING Li  
       Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province·Hubei Institute for Nationalities, Enshi, Hubei 445000, China
       Abstract：ObjectiveTo extract and separate polysaccharide in Dipsacus asper and extract polysaccharide and study its regularities.MethodsDuring the extraction of polysaccharide, the effects of extraction times, temperature, proportion and time on yield of polysaccharide investigated by orthogonal experiment. The separation procedure of precipitation with alcohol and purification from the removing proteins and fats were analyzed. The contents of polysaccharides were determined by anthrone colorimetry. ResultsThe results showed that the optimum parameters were as follows: 2 times extraction ratio of material solvent 1:20, the time 2h, the temperature was 95℃. ConclusionThe regularities of polysaccharide distribution in Dipsacus asper is as follows: the polysaccharide in the roots grew for three years ＞the one for two years＞for one year＞the one in the leaves, the cultivation Wu-He Dipsacus roots ＞ the wild form.
       Key words：Wu-He Dipsacus asper；  Polysaccharide；Extraction；Separation procedure；  The regularities of distribution
       
       五鹤续断属于川续断科植物（Dipsacus asper），药用部位为其干燥根，其产地以湖北鹤峰县、五峰县为主，并且是川续断中的优质品［1］，具有补肝益肾、续接筋骨、抗骨质疏松、止血安胎等功效，临床上主要用于治疗腰膝酸软，跌打损伤，骨折，腰椎骨质增生，先兆性流产和习惯性流产等症状［2］。
       已有研究表明，续断根的热水提取物中存在着抗补体多糖和具免疫调节活性的高分子活性成分［3］。多糖尤其是中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用，而且几乎没有毒性，愈来愈成为当前的研究热点。本研究以五鹤续断为原料，探究续断多糖的提取和动态分布规律，以拓宽五鹤续断的应用范围和产品类型,为进一步开展其药用及保健方面的应用开发奠定基础。
       1  材料与仪器
       1.1  采样及样品预处理
       本研究所用材料均来自恩施州鹤峰县走马镇万寺坪道地药材五鹤续断GAP研究及种植基地，野生续断采自GAP基地周围的环境。采用随机取样的方法，分别取人工种植一年生、二年生、三年生和野生的新鲜植株各10株（其根生长三年以后木质化，不能药用），用无离子水将其根、茎、叶分别洗净，切碎后放在105 ℃的烘箱里杀青30～60 min后，于80 ℃下烘至恒重，将各样品用粉碎机打成粉末，过60目筛，装于试剂瓶中，贴上标签，置于干燥器内贮存备用。
       1.2 仪器与试剂
       植物样品粉碎机，756MC-紫外分光光度计，RE-52型旋转蒸发器，HWS12电热恒温水浴锅，DGX型电热鼓风干燥箱，磁力搅拌器，pH计（PHS-3C），电子天平，冷冻干燥机，低速大容量多管离心机，双重蒸馏水器。95%乙醇、无水乙醇、氯仿、正丁醇、葡萄糖、石油醚、蒽酮、浓硫酸、HClO4、葡萄糖等，所有试剂均为分析纯（由恩施州人合科贸有限责任公司提供），所用水为双蒸水。
       2 方法
       2.1  续断多糖的提取
       工艺流程石油醚脱脂→热水浸提→水提液过滤→冷冻浓缩→乙醇沉淀多糖→Sevage试剂去蛋白→冷冻干燥→测定含量。
       2.2 多糖含量测定
       多糖含量测定采用邹琦主编的植物生理生化实验指导中蒽酮比色法［4］，采用葡萄糖作标准溶液，得线性回归方程曲线为：Y=266.03X-3.004 7，相关系数r2=0.997 6。样品中多糖的测定：吸取样品溶液和蒸馏水（作空白）各1 ml，分别置于试管中，沿壁缓慢加入5 ml冷的蒽酮溶液，混合均匀后，在试管口盖上玻璃塞，在沸水浴上加热10 min后，在流水中冷却20 min，在620 nm波长处以试剂空白作参比，测定吸光度，根据回归曲线查出样品中多糖的浓度。
       3 结果
       3.1  五鹤续断中续断多糖的提取
       3.1.1  石油醚脱脂将实验所要用的五鹤续断样品粉末准确称量后，用滤纸包好置于索氏提取器中，80℃恒温水浴回流6 h后，挥干石油醚即可脱去样品中的脂。在石油醚脱脂的过程中，回收的溶液颜色由深变浅，说明此过程还具有脱色的作用，同时也说明其中的部分色素是脂溶性的物质。
       3.1.2  确定五鹤续断中续断多糖的最佳提取工艺用人工种植的三年生五鹤续断根作为实验材料，以确定其最佳提取工艺。
       影响续断多糖提取率的因素很多，如料液比、温度、时间以及提取次数等，为综合分析各因素的影响程度，本实验采用4因素3水平正交实验［5］L9（34），以确定续断多糖的最佳提取工艺。实验方案设计见表1。表1  影响续断多糖提取因素实验水平表（略）
       根据因素水平表1，按正交实验L9（34）浸提。将浸提液过滤、浓缩后，浓缩液加无水乙醇沉淀，4℃静置过夜后离心(5 000 r/min，15 min)， Sevage试剂去蛋白，冷冻干燥，得续断粗多糖, 重复实验3次，正交实验设计与实验结果见表2。经直观分析，初步筛选出续断多糖提取工艺的最佳水平组合为A2B3C2D2。表2  续断多糖提取正交实验L9（34）结果（略）表3  续断多糖提取方差分析表（略）
       由表2极差分析和表3方差分析可以看出，各因素对续断多糖提取的得率影响大小为B>A> C > D，其中料液比在α=0.05达到显著水平，故续断多糖提取的最佳组合为A2B3C2D2，即提取2次、料液比为1∶20、提取时间2 h、提取温度95 ℃为最佳提取工艺。
       3.2 续断多糖的分离纯化
       3.2.1 确定乙醇分级沉淀多糖的最佳体积本实验采用乙醇作为多糖沉淀剂，将提取所得续断多糖溶液浓缩后，在最优水平下以1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (浸提液:无水乙醇，V/V)进行分级沉淀，4 ℃静置过夜后离心(5 000 r/min，15 min)，冷冻干燥，得到不同体积比的5种续断粗多糖。结果见表4。表4  不同浓度乙醇沉淀多糖结果比较（略）
       比得率以多糖得率最高者为100% 。
       从表4续断粗多糖得率可知，乙醇体积越大，粗多糖得率越高，当滤液与乙醇体积比由1∶4增加到1∶5时，沉淀多糖量几乎保持稳定状态，因此，采用乙醇沉淀多糖时，选用滤液与乙醇体积比为1∶4。
       3.2.2  Sevage法去蛋白本实验采用Sevage（氯仿-正丁醇，体积比4∶1）试剂去除粗多糖中的蛋白质。将上述所得的粗多糖充分溶解后，转入到分液漏斗中，加入等体积的Sevage试剂，剧烈振荡5 min，静置2 h，取其水相，测定280 nm处吸收值，测毕将溶液倒回原水溶液中。将水相再加入等体积的氯仿- 正丁醇溶液，重复上述过程，直至光吸收值基本不变。从脱蛋白结果来看，反复脱11次效果最佳。最后将纯化的多糖进行冷冻干燥后，测定其含量。
       3.3  续断多糖的动态分布规律采用上述确定的五鹤续断多糖的最佳提取、分离和纯化工艺，分别对不同生长期的五鹤续断根和基生叶中的续断多糖进行提取、分离和纯化，并采用蒽酮比色法测定多糖的平均含量。结果见图1。
       分析表明，续断多糖的分布为：三年生根＞两年生根＞一年生根＞叶，野生根是三年生的，其多糖的分布量比三年生人工种植的略低。这表明，在一定生长年限内，人工种植的五鹤续断根中续断多糖的动态分布具有一定的分布规律，即随着生长年限的增加，其根中多糖的平均含量逐年递增，而五鹤续断基生叶中多糖的平均含量与其根相比要低得多，因此，从续断多糖含量的角度分析，五鹤续断药用部位为其根是具有科学性的。
       4 结论
       采用石油醚脱脂、水浸提、乙醇沉淀多糖、sevage试剂脱蛋白等方法研究五鹤续断多糖的提取、分离和纯化的工艺优化，得出如下结论：
       通过续断多糖提取的正交实验分析，确定了续断多糖提取的最佳工艺条件为：提取2次，料液比1∶20，提取时间2 h，提取温度95 ℃。
       在提取续断多糖时，除去蛋白质等杂质用氯仿-正丁醇(体积比4∶1)有较好的效果，迅速、去杂干净，续断多糖损失量较少。
       用乙醇分级沉淀多糖时，采用浓缩液与无水乙醇的体积比为1∶4时，沉淀多糖效果最好，其次为1∶3和1∶5，最差的为1∶1。在工业生产中，可根据原材料成本和续断多糖商品价格选择合适的工艺。
       
       蒽酮比色法测定续断多糖的原理是糖与硫酸反应，脱水生成羟甲基呋喃甲醛，再与蒽酮缩合成蓝色络合物，再用分光光度计测定续断多糖的含量。本法操作简单，显色稳定，灵敏度高，重复性好，可作为续断多糖及其它多糖含量的测定方法。
       
       药用植物五鹤续断根中多糖含量较高。续断多糖具有较强的免疫调节活性，随着对多糖理化性质、结构和药理作用的深入研究，开发利用五鹤续断多糖保健品或药物制剂，具有一定的现实意义和开发价值。
       【参考文献】
         　　［1］张万福.湖北“五鹤续断”的地道历史考证及开发前景［J］.湖北民族学院学报(医学版),2002,19(3):24.
       
       ［2］全国中草药汇编写组. 全国中草药汇编，下册［M］.北京:人民卫生出版社,2000：135.
       
       ［3］严忠红.川续断根部免疫调节多糖的分离和化学性质［J］.植物学分册,1998,13(3):122.
       
       ［4］邹琦.植物生理生化实验指导［M］.北京：中国农业出版社，1997:5,53.
       
       ［5］孙国红,王学会. 概率论与数理统计学习指南［M］.天津:南开大学出版社,2005.