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       【摘要】 
       目的探讨胆囊收缩素受体CCKB-R mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达及加减益胃汤对其表达的影响。方法借助特制饲料喂养幼龄厌食大鼠模型，采用RT-PCR技术检测CCKB-R在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达，并观察加减益胃汤对该模型CCKB-R表达的影响。结果正常大鼠结肠平滑肌细胞中CCKB-R有低水平表达，特制饲料喂养造模后其表达水平异常增高，与空白对照组比较有极显著的统计学意义（P＜0.001）；加减益胃汤高、中、低剂量组均能显著抑制或下调CCKB-R的高表达，且有一定的量-效趋势。结论CCKB-R基因高表达可能是厌食发生的主要病理环节之一，抑制或下调CCKB-R基因表达可能是加减益胃汤治疗厌食症的主要作用靶点之一。
       【关键词】  胆囊收缩素受体；厌食
       Expression of CCKB-R mRNA in Colon Smooth Muscle Cells of the Anorexia Pedo-rats
       ZHAO Qiong, LIAO Min, DING Weijun, LI Xiuliang, QU Jia
       Chengdu University of TCM, Sichuan Chengdu 611137, China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats, and the effect of modified Yi Wei Decoction on it.MethodsThe anorexia rat model was establisbed by feeding rats with specially prepared forage. The expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats was examined by RT-PCR, and the effect of modified Yiwei decoction on it was observed.ResultsCompared with blank control, the expression of CCKB-R mRNA in anorexia rats was significantly increased (P＜0.001). Highdosage, middledosage or lowdosage of Yiwei decoction all could obviously decrease the expression of CCKB-R mRNA as compared with model group(P＜0.001).ConclusionThe expression of CCKB-R mRNA can be obviously increased in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats, which is one of the mechanisms of anorexia.Modified Yiwei decoction can decrease the expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia rats.
       Key words：CCKB-R;  Anorexia
        近年来研究证实胆囊收缩素（CCK）等脑肠肽在小儿厌食症的发病中起着重要的作用，但对其受体表达及进一步的分子信号转导机制还不十分清楚。本研究在近年来中药复方加减益胃汤治疗小儿厌食症取得良好临床疗效和我们前期研究［1］的基础上，借助特制饲料喂养幼龄厌食大鼠模型，对CCKB-R在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达及加减益胃汤对其表达的影响进行了初步研究。现报道如下。
       1  材料与仪器
        加减益胃汤：北沙参15 g，麦冬10 g，乌梅5 g，山药15 g，莲米15 g，生麦芽15 g，生谷芽15 g，藿香10 g等（由成都中医药大学制剂教研室制备）；阳性对照药：儿宝颗粒（江西清江制药厂产品，产品批号：050411）。抑肽酶（丽珠集团丽宝生物化学制药有限公司产品），50 000 KIU/支，使用前用生理盐水稀释为25 IU/ml；PCR 反应试剂盒：TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司生产。PCR仪：Thermo Hybrid生产，型号：Px2；凝胶成像系统：BIO-RAD生产，型号：GEL-DOC。
       2 方法
       2.1 分组及造模
       2.1.1 动物及分组实验用SD大鼠72只（成都中医药大学动物实验中心提供，SPF级动物），日龄40～45 d，体重（75±10）g，随机分为6组，即空白对照组、模型组、阳性对照组、加减益胃汤高、中、低剂量组，每组12只。
       2.1.2 造模及给药方法除空白对照组外，其余各组参考文献［2］采取特制饲料喂养“病因模拟”法造模。灌胃给药，实验过程中每日记录动物进食量，实验第8天开始灌胃，空白对照组和模型组灌生理盐水，阳性对照组灌服儿宝颗粒，加减益胃汤低剂量组灌服17.5 g生药/kg，加减益胃汤中剂量组灌服35 g生药/kg，加减益胃汤高剂量组灌服70 g生药/kg，1次/d。第28天晚8时起禁食，第29天处死，取标本。
       2.2 样本提取与保存大鼠处死后，迅速剪取结肠中段, 生理盐水洗尽血迹，去除黏膜层, 取肌层组织并置于液氮中保存待测。
       2.3  RT－PCR检测CCKB-R表达
       2.3.1 引物设计与合成  
       从美国国立卫生院所维护的国际权威数据库网站获得最新版本的CCKB-R和内参基因β-actin的mRNA序列。利用引物设计专业软件Primer Primier 5.0设计其引物。然后委托大连宝生物完成引物合成。将引物溶于去离子水之中，终浓度调整为20 pmol/μl，－20℃保存备用。CCKB受体引物：5"-CTAAGAACGGTCACCAACG；3"-GTGTAAGTAGAAGCCGTG。
       2.3.2 RNA 提取 
       采用美国TriZol试剂(Cat NO: 15596-018)，按试剂盒提供的方法提取结肠中段组织中的总RNA，各组使用相同剂量的结肠中段组织总RNA。1.5%琼脂糖电泳确定质量与含量后，－80℃保存备用。
       2.3.3 RT－PCR
       按试剂盒说明程序进行，先经逆转录酶系统合成cDNA。PCR仪进行CCKB-R扩增，取10 μl cDNA反应液进行PCR。PCR的条件：①变性：94℃预变性5 min，94℃变性1 min；②退火：54℃，30 s；③延伸72℃，30 s。30个循环后，72℃再延伸10 min终止反应，4℃。CCKB-R PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳（电压100 V，时间30 min），取出后于紫外线下观察，利用凝胶成像系统分别测定扩增条带的积分光密度值。比较各组CCKB-R相对光密度值并进行组间统计，判定CCKB-R mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达及加减益胃汤对其表达的影响。
       2.4 统计学处理数据用SAS 软件包处理，计量资料均以±s表示。多组资料比较用方差分析，两组资料比较用t检验。
       3 结果
        见表1。表1  实验各组对幼龄厌食大鼠结肠平滑肌
       组织CCKB-R mRNA表达的影响（略）
       表1所示，模型组CCKB-R mRNA表达与空白组比较有显著差异（P＜0.001）；与模型组比较，阳性药组、加减益胃汤高剂量组、中剂量组、低剂量组均使结肠平滑肌组织CCKB-R mRNA表达下调（P＜0.001）；与阳性药组比较，加减益胃汤各组下调CCKB-R mRNA表达程度高于阳性药组，但差异不显著；加减益胃汤各组间比较无显著性差异（P>0.05），但下调CCKB-R mRNA表达水平表现为高剂量组＞中剂量组＞低剂量组，有一定量-效关系趋势。
       4 讨论
        胆囊收缩素（cholecystokinion, CCK）是一种广泛分布于中枢及外周神经系统的典型的脑肠肽，具有调节胃肠运动、消化液分泌、摄食、情绪、记忆等多种生理功能。研究结果已证实，小儿厌食症的临床表现与八肽胆囊收缩素（CCK-8）等脑肠肽水平和胃肠运动功能状态有着密切的关系。文献报道“病因模拟”厌食模型鼠中枢和外周CCK-8均显著增高［3］，但CCK受体在厌食症发病中的具体作用机制尚不十分清楚。
       
       CCK对胃窦、幽门、小肠、胆囊平滑肌细胞有收缩作用，能增强胆囊收缩和小肠结肠的动力，且通过其受体及信号转导通路发挥其生理作用。通常认为CCK与胃肠平滑肌细胞膜上的CCK-B受体结合后使G蛋白活化，激活膜上的磷脂酶C（PLC）信号级联，通过Ca2+-CaM途径产生胃肠平滑肌细胞收缩。据此，本实验研究中幼龄厌食大鼠模型结肠CCK-B受体基因较空白组表达显著增高(P<0.05), 提示幼龄厌食大鼠模型结肠CCK耦联Ca2+-CaM信号通过高度活化，受体上调，使胃肠平滑肌收缩增强。然而近年的研究表明，CCK 对进食后的胃排空有抑制作用。Wechsung 等［4］研究发现,CCK通过舒张近端胃和提高幽门括约肌张力以及改变胃排空模式对胃排空发挥抑制作用。也有学者发现，即使是胆囊平滑肌收缩“正常”的胆囊结石患者,其CCK 受体mRNA 表达亦显著低于正常人［5］。因此本实验特制饲料喂养幼龄大鼠后CCK受体表达上调，可能使胃肠平滑肌收缩异常，平滑肌处于紧张或痉挛状态，胃排空抑制，胃肠运动减弱，排空减慢，进而产生饱胀感、厌食等。而加减益胃汤通过下调胃肠CCK-B受体基因表达，使高表达的CCK-B受体恢复正常，胃肠平滑肌紧张或痉挛状态缓解，胃肠运动恢复正常，从而达到治疗厌食的目的。
       
       我们推测，由于CCK-8对摄食的控制有两种作用方式，一是脑组织分泌的CCK-8的中枢作用，二是腹迷走神经传入纤维介导的外周CCK-8的作用。而CCK 对消化管运动的调节有神经介导和直接作用于平滑肌两种途径。CCK 直接作用于平滑肌, 因需较高浓度的CCK, 故认为只有较低的亲和力。CCK 对消化管的调节被认为主要是以高亲和力的神经调节为主。因此，CCK对胃肠道平滑肌的作用主要依靠的是神经调节。但由于生理状态下体内CCK 的作用浓度还不清楚，其他激素、神经递质等与CCK在厌食发生中的相互作用影响又是怎样的，CCK受体在厌食症发病中的具体作用机制还需要我们进一步深入研究和探讨。
       【参考文献】
         　　［1］赵琼，徐世军，崔敏俐.加减益胃汤治疗小儿脾胃阴虚厌食症的实验研究［J］.成都中医药大学学报，2005,28（3）：15.
       
       ［2］汪受传,张月萍.特制饲料喂养幼龄大鼠建立小儿厌食模型［J］.南京中医药大学学报，1999，15（3）：148.
       
       ［3］彭玉,吴高鑫.运脾散对厌食大鼠下丘脑和血浆CCK－8的调节作用［J］.中医儿科杂志，2007，3(2):20.
       
       ［4］Wechsung E, Houvenaghel A. Effect of CCK－8 on myoelectrical activity of the gastrointestinal tract in the conscious miniature pig［J］. Peptides,1995,16(8):1429.
       
       ［5］朱铭岩,王志伟，陈锦鹏，等.胆囊结石患者CCK受体mRNA 测定的临床意义［J］.肝胆胰外科杂志，2004,16（4）：255.