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       【摘要】 
       目的探讨中药大青叶单体1#，2#，3#，4#体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用。方法通过观察病毒引起的细胞病变效应（Cytopathogenic effect,CPE）和MTT［Methyl Thiazolyl Tetrazolium，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐］法检测药物抗RSV活性, 计算药物对病变的抑制率和半数抑制浓度（50% inhibiting concentration ,IC50），并从药物抗病毒吸附，药物对病毒的直接杀灭作用及抑制病毒在细胞内的生物合成3个方面初步探索大青叶单体抗RSV活性的作用机制。结果大青叶单体1#，2#，3#，4#对RSV无直接灭活作用,也不能阻止RSV的吸附，而能抑制RSV在Hep-2细胞内的的生物合成，其半数抑制浓度(IC50)分别为32.57，26.37，31.60，29.61 μg/ml,治疗指数(TI) 分别为6.15，10.50，9.21，13.22，其抗病毒效果优于病毒唑(IC50=103.20 μg/ml, TI=5.21)和抗病毒口服液(IC50=105.21 μg/ml, TI=5.03) ，P<0.01。结论大青叶单体1#，2#，3#，4#能安全高效地抑制RSV在Hep-2细胞中的增殖，抑制作用发生在病毒入侵细胞后。
       【关键词】  大青叶 单体 呼吸道合胞病毒 细胞病变效应法 MTT法
       大青叶（Folium Isatidis，简称FI）为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort的干燥叶。味甘，气寒，无毒，入肝、心、胃经，清热凉血，为解毒要药。《名医别录》记载：“疗时气头痛，大热，口疮。”《本草纲目》记载：“主热毒痢，黄疸，喉痹，丹毒。”它既能清心胃实火，治温热病心胃毒盛，发斑发疹，又善解毒利咽，凉血消肿，用治喉痹口疮、咽喉肿痛。据报道，大青叶在临床上多用于流行性感冒持续高热、上呼吸道感染、流行性乙型脑炎、急性传染性肝炎等病毒性疾病。而呼吸道感染中90%以上是由呼吸道病毒引起，其中呼吸道合胞病毒（RSV）居首位［1］。鉴于此，我们从中药大青叶中提取有效成分，制备成大青叶单体，实验选用微孔细胞培养和MTT法，以Hep-2细胞作为体外筛选细胞模型，检测其对RSV的抑制作用，为筛选新型抗病毒药物和大青叶的临床应用提供思路和理论依据。
       1  材料
       中药大青叶（Folium Isatidis，简称FI）单体1，2，3，4#（褐色颗粒，溶于水），由华中科技大学同济医学院同济医院药剂科方建国教授提供。病毒唑和抗病毒口服液由南京第三制药厂生产，批号080302。Hep-2(鼻咽癌)细胞为武汉大学典型培养物保藏中心提供，RSV由英国Glasgow大学儿童卫生系Paton博士赠送。RPMI- 1640和 MTT为Hyclone公司产品。二甲基亚砜（DMSO）由上海菲达有限公司提供。新生小牛血清购自三利公司。
       2  方法
       2.1  病毒滴度测定将毒株作10倍系列稀释，每个稀释度重复10孔，同时设正常细胞对照。于37℃下孵育2 h，换细胞维持液。每天观察细胞病变效应（CPE），约3～7 d后CPE不再增多时，按Reed-Muench方法计算TCID50。
       2.2  药物对细胞的毒性的测定用乙酶将生长良好的Hep-2细胞分散成单个细胞悬液，按1×105/ml浓度分种于40孔板，每孔0.1 ml。置33℃，5%CO2培养箱中培养24 h。待细胞长成单层后，弃培养液上清，换含不同浓度的含药维持液，每孔200 μl。大青叶1，2，3，4#单体的浓度分别为10，20，40，80，160，320，640，800，1 600 μg/ml。每种浓度重复4孔，实验同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和中药抗病毒口服液对照。继续培养48 h后，以MTT法检测细胞存活率。并根据如下公式计算细胞存活率，找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。细胞存活率（%）=（药物组平均OD570 /细胞对照组平均OD570）×100%。
       2.3  细胞活性测定(MTT染色法)根据Mosmann建立的四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞活性。弃培养上清液,每孔加5 mg/ml MTT的不含血清的RPMI-1640 50 μl，37℃,5%CO2孵育4～6 h, 黄色的MTT被活细胞的线粒体脱氢酶还原成蓝色的甲簪结晶，小心吸出MTT, PBS洗3次，每孔加50 μl DMSO终止反应,振荡混匀, 在15 min后甲簪结晶被溶解,在波长570 nm下测定吸光度OD值。OD值与活细胞的数量呈正相关。
       2.4  药物抗RSV活性机理的实验
       
       2.4.1  药物对RSV生物合成的抑制作用实验于已长成单层的Hep-2细胞40孔板上，每孔接种100 μl的100TCID50的RSV病毒液，于33℃吸附90 min，弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结果，在大青叶无毒浓度范围内，加入2，4，8，16，32，64，128 μg/ml的不同浓度的含药维持液每孔0.2 ml，每日观察CPE,隔天换新鲜含药维持液。实验同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和抗病毒口服液对照。约在病毒对照CPE为 “+++～++++”（CPE记录方法为：“-”为无CPE;“+”为25%细胞出现CPE;“++”为50%细胞出现CPE；“+++”为75%细胞出现CPE;“++++”为100%细胞出现CPE）时弃培养液上清，用MTT法检测病毒抑制率,并根据如下公式计算药物对RSV的病毒抑制率［2］。
        病毒抑制率（%）=药物处理组OD570-病毒对照组OD570细胞对照组OD570-病毒对照组OD570×100%
       2.4.2  药物直接灭活病毒实验将50 μl的100 TCID50/ml滴度的RSV和150 μl不同浓度的药物作用4 h，反应体系为0.2 ml。含并保证药物的终浓度与药效学实验相同。然后将混合液接种于单层Hep-2细胞中,孵育1.5 h后，换用2%MEM培养液维持细胞生长，37℃，5%CO2培养,逐日观察CPE。
       2.4.3  药物抗病毒吸附实验分别将不同浓度的药物加到Hep-2单层细胞孔中, 37℃吸附90 min,弃上清,再加 100 TCID50/ml滴度的RSV 100 μl/孔, 37℃吸附90 min后,弃上清,加细胞维持液,37℃，5%CO2培养,逐日观察CPE。
       3  结果
       3.1  病毒滴度按Reed-Muench法计算病毒的TCID50为10-4，即接种滴度为10-4的病毒每孔0.1 ml，可使50%细胞发生明显病变。实验用病毒浓度为100 TCID50。
       3.2  药物对细胞的毒性将大青叶单体1，2，3，4#和病毒唑及抗病毒口服液的不同浓度对细胞的毒性。结果见表1。表1  大青叶单体1，2，3，4#对Hep-2细胞的毒性作用（略）
       
       通过光镜观察,大青叶单体1#，2#，3#，4#对Hep-2细胞毒性作用表现为：细胞粘连，变圆，壁厚，破碎，脱落，胞浆内颗粒增加，折光性增强。并且吸光值明显下降，吸光度OD值在0.10以下。从表1可知，大青叶单体1#，2#，3#，4#与病毒唑和抗病毒口服液的TC50>200 g/ml,说明其安全系数大。药物在160 g/ml范围内约有半数或以上的细胞存活，从而确该药物浓度为对Hep-2细胞敏感病毒的抗病毒实验的最高允许浓度；但细胞经较高浓度的药物作用后，药物毒性增强，死亡细胞数增加，细胞存活率降低（如图1所示）。经直线回归分析，药物浓度与细胞存活率之间存在直线关系，P<0.01。其直线方程和相关系数分别为：Y1# = 59.006－0.042X，r1# = －0.815；Y2# = 63.976－0.045X，r2# = －0.827；Y3#= 64.466－0.045X，r3#= －0.835；Y4# =69.451－0.045X，r4#  = －0.849。4者相比较，1#单体的毒性最大，经t检验，P<0.01；2#单体与3#单体对细胞的毒性作用相同，经t检验，P>0.05；4#单体毒性最小，经t检验，P<0.01。但将4种单体的TC50与阳性药物病毒唑及抗病毒口服液相比，经t检验，P<0.01,有显著性差异，说明大青叶单体的毒性更大。
       3.3  药物抗病毒生物合成的作用RSV对Hep-2细胞CPE表现为细胞肿胀、变圆，壁厚，折光性减弱，多个细胞融合形成大泡，有合胞体形成48～72 h后，用MTT法按公式计算大青叶单体1#，2#，3#，4#对RSV的抑制率，并根据治疗指数TI= TC50/IC50，计算各种药物的治疗指数。结果见表2。表2  中药大青叶单体1，2，3，4#的抗RSV细胞内生物合成作用（略）
       
       由表2可知随药物浓度增加，其抗病毒活性增强，病毒抑制率升高（见图2）。经直线回归分析，药物浓度与病毒抑制率间有直线关系，P<0.01。其直线方程和相关系数分别为：Y1#=31.044+0.530X，r1#=0.898；Y2#=34.135+0.538X，r2#=0.806；Y3#=29.490+0.572X，r3#=0.904；Y4#=33.495+0.506X，r4#=0.923。药物浓度在在128 g/ml以上时，对RSV细胞病变抑制程度可达90%左右。4种单体的IC50和TI相比较，4#单体的IC50值略小，TI值略大于其他3号单体。但通过t检验，4种单体间抗RSV活性无显著性差异，P>0.05。将4种单体在2～128 g/ml 范围内的抗RSV抑制率与阳性对照药物相比，经t检验，P<0.01，有显著性差异，大青叶单体的体外抗RSV优于病毒唑和抗病毒口服液。
       
       3.4  药物直接灭活病毒的作用和药物抗病毒吸附的作用按实验方法“2.4.2”和“2.4.3”项将药物与病毒混合后再作用与细胞,或者将药物与细胞作用后再感染病毒,逐日观察细胞病变。通过光镜观察，发现各提取部位不同浓度组均出现典型RSV感染所致的CPE，且与病毒对照孔无显著区别。通过测定各孔OD570并计算不同药物浓度时的病毒抑制率，也没有高于7%的抑制率和随药物浓度增加而病毒抑制率升高的趋势，说明各单体均不能直接杀灭RSV，也无阻断其吸附作用。
       4  讨论
       呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV) 是一种RNA病毒，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)［3］。它是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染, 特别是病毒性肺炎(约50%)和毛细支气管炎(约90%)的重要病原［4］。RSV每年易在冬春季引起暴发流行,持续约5个月，2岁内儿童为高发感染人群；在成人特别是老年人和免疫抑制的人群也有爆发流行，而目前FDA批准用于防治RSV感染的药物，仅有病毒唑（ribavirin），它应用中常出现白细胞减少，剂量过大时可致头痛、不可逆贫血、血清胆红素升高等副作用，动物实验有致畸的报道，在临床尤其是婴幼儿的应用受到限制。而RSV疫苗也存在安全有效性待测和价格昂贵等缺点。我们选用清热解毒中药大青叶，在实验中发现，大青叶单体对细胞毒性小，其无毒浓度在200 μg/ml以上，对RSV所致的细胞病变具有较好的抑制作用，在2～128 μg/ml这一段浓度范围内均呈现了较明显的量效关系, 说明当药物不足以结合所有的病毒时,剩余的病毒颗粒还会具有感染细胞并引发细胞病变的能力；当药物的量足够时,可以将绝大部分的病毒粒子结合从而避免细胞的感染。但当药物浓度大于128 μg/ml时，其对细胞的毒性作用则掩盖了其抗病毒作用。但其单体成分对细胞的毒性比病毒唑要大，说明还需要改进提取工艺，或修饰其结构，使其毒性降低。
       抗病毒实验中3种不同的加药方式表明，它对病毒无直接杀灭作用，可能是由于中药成分温和，不含有能破坏病毒的包膜的有效成分或活性化合物；亦不能保护细胞免受病毒感染，可能由于它不能针对细胞表面的单一病毒受体的成分, 不能与细胞表面受体结合, 从而不能预防病毒的感染。但是它对已经进入胞内的呼吸道合胞病毒均有一定的抑制作用，能抑制病毒核酸复制或者阻止病毒蛋白合成，说明其可能干扰或抑制了病毒基因组的释放、复制或转录。其具体抗病毒机制值得从动物体内或者血清药理学、分子生物学等进一步深入研究。
       【参考文献】
         　　［1］Suk Ran Kim, Chang-Seok Ki, Nam Yong Lee.Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay［J］. Journal of Virological Methods，2009, 156(1-2): 111.
       
       ［2］Zalilawati Mat Rashid, Elodie Lahaye, Diane Defer.Isolation of a sulphated polysaccharide from a recently discovered sponge species (Celtodoryx girardae) and determination of its anti-herpetic activity［J］.International Journal of Biological Macromolecules. 2009, 44(3): 286.
       
       ［3］N.D. Day, P.J. Branigan, C. Liu, et al. Contribution of cysteine residues in the extracellular domain of the F protein of human respiratory syncytial virus to its function［J］.BMC Virol. J. 2006,3: 34.
       
       ［4］Lauren R. Sorce RN, MSN, CCRN, CPNP-AC/PC, FCCM.Respiratory Syncytial Virus: From Primary Care to Critical Care［J］.Journal of Pediatric Health Care, 2009,23(2): 101.