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       【摘要】 
       目的研究羟基喜树碱对人胰腺癌PANC-1细胞生长的抑制作用及其作用机制。方法MTT法测定羟基喜树碱对PANC-1细胞生长的抑制作用；流式细胞仪检测羟基喜树碱对PANC-1细胞周期、凋亡率和Caspase-3活性的影响。结果羟基喜树碱能抑制PANC-1细胞生长，并呈剂量依赖关系，其半数抑制浓度(IC50)为51.52 μg/ml；流式细胞仪检测显示低浓度羟基喜树碱处理后可将细胞先后阻滞于S 期和G2/M 期，高浓度的羟基喜树碱则诱导细胞凋亡；细胞凋亡率和Caspase-3活性随药物浓度升高和处理时间延长而逐渐递增。结论羟基喜树碱能抑制人胰腺癌PANC-1细胞的生长，其抗肿瘤作用机制与阻断细胞周期、诱导细胞凋亡和激活Caspase-3活性有关。
       【关键词】  羟基喜树碱 人胰腺癌细胞PANC-1 抗肿瘤作用
        羟基喜树碱（Hydroxycamptothecin, HCPT）是从我国珙桐科植物喜树中分离出的20多个单体中抗癌作用最强的微量植物碱，是一种DNA拓扑异构酶I（DNA topoisomerase I, DNA TopoI）抑制剂。大量的临床研究证明，羟基喜树碱具有抗肿瘤作用强和毒性低的优点，具有广谱抗肿瘤作用，对多种肿瘤细胞株及移植瘤有较高的抑制率［1］。目前羟基喜树碱对胰腺癌的治疗研究很少［2］，为此本文研究了羟基喜树碱对胰腺癌细胞PANC-1的抑制作用及其作用机制，以期为临床应用提供理论基础和依据。
       1   材料与仪器
       1.1   细胞系人胰腺癌细胞PANC-1由日本大阪大学消化器一般外科赠送。
       1.2   药品与仪器羟基喜树碱针剂（贵州汉方制药有限公司提供，批号20030403）；噻唑蓝（MTT）、DMEM高糖培养基（GIBCO公司产品）；二甲基亚砜(DMSO，上海生物工程有限公司产品) ；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品）；细胞周期测定试剂盒、Caspase-3活性测定试剂盒、流式细胞仪（Bection Dikinson公司产品）； CO2培养箱（Forma公司产品）；Multiskan MK3酶标仪(Thermo Labsystems公司产品)。
       2   方法
       2.1   细胞培养将PANC-1细胞接种于含10％灭活新生牛血清的DMEM高糖培养液中（不含抗生素），在37℃、5％CO2、饱和湿度下培养。3 d传代1次，隔天换液1次，取对数生长期的细胞进行实验，分别用各种浓度的羟基喜树碱处理细胞，未加药组为对照组。
       2.2   细胞生长抑制率的测定采用噻唑蓝还原法进行检测。取对数生长期的PANC-1细胞接种于96孔培养板中(密度为1×104/孔)，每组设6个平行孔。加入用DMEM高糖培养液稀释的不同浓度羟基喜树碱(6.25，12.5，25，50，100，200，400 μg/ml)分别培养，以未加羟基喜树碱为对照组。加药培养48 h后每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，37 ℃继续培养4 h后，离心后吸去上清液，每孔加入DMSO 100 μl，振荡10 min使结晶充分溶解,酶标仪570 nm 波长检测各孔吸光度(A值),计算细胞生长抑制率及半数抑制浓度（IC50）值。细胞生长抑制率（%）=(1-实验组平均A值/对照组平均A值) ×100%。
       2.3  细胞周期及凋亡率测定收集不同浓度羟基喜树碱(0，6.25，25，100μg/ml)处理24、48和72 h后的PANC-1细胞，预冷的PBS洗涤细胞两次，预冷的70%乙醇固定过夜。2 000 r/min离心10 min，弃去乙醇，再次悬浮于预冷的PBS，细胞经溴化丙啶(PI，10 μg/ml)染色5 min，4℃避光30 min后，上流式细胞仪，激发光波长为488 nm，吸收波长610 nm。检测细胞DNA水平，根据DNA水平在流式细胞仪中得出每份样品的G0/G1，S和G2/M期细胞分布图。LY-SIS软件(Becton Dickinson公司产品)分析。
       2.4  细胞Caspase-3活性（相对荧光值）测定收集不同浓度羟基喜树碱(0，6.25，25，100 μg/ml)处理24，48和72 h后的PANC-1细胞，预冷的PBS洗涤细胞2次，预冷的70%乙醇固定过夜。2 000 r/min离心10 min，弃去乙醇，再次悬浮于预冷的PBS，按Caspase-3活性测定试剂盒说明书进行操作,上流式细胞仪测定Caspase-3活性（相对荧光值）。
       2.5   统计学分析采用统计软件SPSS 14.0进行数据处理。
       3   结果
       3.1   羟基喜树碱对PANC-1细胞生长抑制率的测定结果见图1。羟基喜树碱能有效抑制PANC-1细胞生长，6.25，12.5，25，50，100，200及400 μg/ml羟基喜树碱对PANC-1细胞的生长抑制率分别为(9.9±5.2)%、(20±5.7)%、(35.8±6.9)%、(46.5±2.1)%、(65.6±3.4)%、(78.7±1.5)%、(89±1.6)%，其抑制作用呈浓度依赖性，半数抑制浓度（IC50）为51.52 μg/ml，95%可信区间为(43.19～61.49) μg/ml。
       
       3.2   羟基喜树碱对PANC-1细胞周期及细胞凋亡的影响PANC-1细胞分别经6.25，25和100 μg/ml 羟基喜树碱作用后，细胞周期和凋亡率产生了明显的变化（见表1）。与对照组比较，低浓度的羟基喜树碱（6.25 μg/ml）处理后G0/G1期比率明显下降，S期和G2/M期比率明显上升，未出现明显细胞凋亡；25μg/ml组S期比率上升，G2/M期比率明显下降，处理48 h出现明显细胞凋亡；100 μg/ml组G0/G1期比率上升，G2/M期比率下降，细胞凋亡为主；细胞凋亡率随着羟基喜树碱浓度升高和处理时间延长而明显上升。
       3.3   羟基喜树碱对PANC-1细胞Caspase-3活性的影响结果见图2。与对照组比较，羟基喜树碱处理组PANC-1细胞Caspase-3活性明显上升(P<0.05)，且随着羟基喜树碱浓度的升高和处理时间的延长而逐渐递增。表1  羟基喜树碱对PANC-1细胞周期和凋亡率的影响（略）
       
       4  讨论
        胰腺癌是恶性程度最高的致死性肿瘤之一，多数胰腺癌患者明确诊断时已属中晚期，由于其侵袭性强，诊断后中位生存期不到6个月，预后很差，但是目前胰腺癌临床化疗效果并不令人满意［3］。本研究结果表明羟基喜树碱对胰腺癌细胞PANC-1有较强的生长抑制作用，应是治疗胰腺癌较好的化疗药。
        羟基喜树碱是细胞周期特异性药物，主要作用于S 期，并对G2/M 期边界有延缓作用；它能够抑制DNA 拓扑异构酶Ⅰ将DNA 断端重新接合的正常功能，并进一步造成DNA 链的断裂损伤，从而抑制DNA的复制，阻断RNA的合成（即转录）、干扰细胞分裂周期（延迟G2 期），最终导致肿瘤细胞死亡［4，5］。Goldwasser等［6］的研究显示，低浓度羟基喜树碱作用人结肠癌细胞SW620后可阻断细胞周期于G2/M 期，但高浓度的羟基喜树碱则阻滞于S 期。与该研究相似，本研究显示胰腺癌细胞PANC-1在低浓度羟基喜树碱作用下，细胞周期被先后阻滞于S 期和G2/M 期，当羟基喜树碱为25μg/ml时，则阻滞于S 期，该结果说明低浓度羟基喜树碱造成DNA 损伤及抑制DNA 复制的强度有限，因此，部分细胞仍可进入G2/M 期，同时由于羟基喜树碱具有干扰细胞分裂周期的功能，故可将这部分细胞阻断在G2/M 期，但当羟基喜树碱浓度进一步升高时对DNA 的损伤作用增强，则细胞被完全阻断在S 期。许多研究还显示羟基喜树碱可诱导肿瘤细胞凋亡［7，8］，本研究也显示在较高浓度时，羟基喜树碱先将细胞周期阻滞于S期，然后诱导细胞凋亡，细胞凋亡率随着羟基喜树碱浓度升高和处理时间的延长而明显上升。
        细胞凋亡的分子机制研究表明，凋亡是多基因参与的级联反应过程。Caspase-3 是凋亡的执行器之一，多种刺激因子通过触发凋亡的信号转导途径，激活启动子Caspase 8、9、10，最终触发效应器Caspase3、6、7［9～11］。本研究中，细胞凋亡率随着羟基喜树碱浓度升高和处理时间的延长明显上升，而细胞Caspase-3活性也随着羟基喜树碱浓度升高和处理时间的延长逐渐递增，因此证明羟基喜树碱依赖Caspase-3途径诱导PANC-1细胞凋亡。
        综上所述，羟基喜树碱对PANC-1细胞具有明显的生长抑制作用，其作用机制可能是通过抑制DNA 拓扑异构酶Ⅰ，导致DNA 的损伤，从而干扰细胞周期（阻滞于S 期及G2/M 期）以及依赖Caspase-3途径诱导细胞凋亡，最终导致PANC-1细胞死亡。
       【参考文献】
         　　［1］Zhang R, Li Y, Cai Q, et al. Preclinical pharmacology of the natural product anticancer agent 10-hydroxycamptothecin, an inhibitor of topoisomerase I［J］ . Cancer Chemother Pharmacol,1998，41(4):257.
       
       ［2］顾群浩, 廖 泉, 张胜华,等. 羟基喜树碱对人胰腺癌细胞作用的研究［J］.现代中西医结合杂志, 2004,13 (5):570.
       
       ［3］Bornman P C, Beckingham I J. ABC of diseases of liver, pancreas, and biliary system. Pancreatic tumours［J］. BMJ,2001,322(7288):721.
       
       ［4］McDonald A C, Brown R. Induction of p53-dependent and p53-independent cellular responses by topoisomerase 1 inhibitors［J］ . Br J Cancer, 1998, 78 (6 ): 745.
       
       ［5］Cusack J C. Rationale for the treatment of solid tumors with the proteasome inhibitor bortezomib［J］. Cancer Treat Rev,2003,29(1):21.
       
       ［6］Goldwasser F, Shimizu T, Jackman J, et al. Correlations between S and G2 arrest and the cytotoxicity of camptothecin in human colon carcinoma cells［J］ . Cancer Res, 1996, 56 (19 ):4430.
       
       ［7］涂水平, 江石湖, 谭继宏, 等. 羟基喜树碱诱导胃癌细胞凋亡的作用机制初步研究［J］.中华消化杂志, 2001,21(5):274.
       
       ［8］柴丽萍, 苏振忠, 冼志雄. 羟基喜树碱对喉鳞癌细胞株抑制作用的研究［J］.癌症,2003, 22 (4):372.
       
       ［9］Yang Y, Li C C, Weissman AM. Regulating the p53 system through ubiquitination［J］. Oncogene,2004, 23 (11):2096.
       
       ［10］Kim K W,Kim B J, Chung C W, et al. Caspase cleavage product lacking amino-terminus of IkappaBalpha sensitizes resistant cells to TNF-alpha and TRAIL-induced apoptosis［J］. J Cell Biochem,2002,85(2):334.
       
       ［11］Fu Y R, Yi Z J, Yan Y R, et al . Hydroxycamptothecin-induced apoptosis in hepatoma SMMC-7721 cells and the role of mitochondrial pathway［J］. Mitochondrion, 2006, 6(4):211.