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       【摘要】 
       目的探讨四神丸化裁前后治疗实验性溃疡性结肠炎的效果及作用机制异同。方法50只小鼠分成5组：即正常组、模型组、四神丸组、加味四神丸组和阳性对照组，采用传统的DSS法复制小鼠溃疡性结肠炎模型，给药10 d后，观察其病理组织学变化，并采用流式细胞术检测其结肠上皮细胞凋亡率，用ELISA测定其外周血PAF及其结肠组织匀浆TNF-α，IL-10，TGF-β表达水平。结果各治疗组结肠指数、结肠损伤评分、病理组织学评分及细胞凋亡率较模型组明显下降（P＜0.01或P＜0.05）。同时四神丸明显升高TGF-β表达水平（P＜0.05），而对TNF-α，IL-10，PAF表达水平作用不明显。而加味四神丸则可显著降低TNF-α及PAF表达、升高TGF-β水平较明显（P＜0.01或P＜0.05），同时，两治疗组之间比较，可见加味四神丸降低TNF-α，PAF表达，升高IL-10水平明显优于四神丸组。结论四神丸和加味四神丸二者均可有效缓解实验性溃疡性结肠炎的炎症损伤，其作用机制的差异性可能在于加味四神丸可以通过抑制血小板活化因子，调节结肠局部促/抗炎因子之间的平衡来实现，而四神丸可能是通过升高TGF-β表达水平，促进上皮损伤后修复，溃疡愈合。
       【关键词】  四神丸化裁 溃疡性结肠炎 疗效 机制
        溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)是以直肠、结肠黏膜及黏膜下层的炎症和溃疡形成为病理特点的慢性非特异性肠道疾病［1］。其属于中医”泄泻”“久痢” “肠癖”“滞下”“肠风”“脏毒”等范畴，其病机多认为是以脾肾亏虚为本，以湿热为标，同时也有很多医家认为溃疡性结肠炎反复发作、缠绵难愈，血瘀是UC发病过程中的一个中心环节［2］。因此治疗时常见常用治法和活血化瘀法联合使用，疗效显著［3］。尽管两者都有效，但其作用机制不明。
       1  材料
       1.1  动物及分组健康雄性昆明小鼠（南昌大学医学院实验动物中心），雄性，18～22 g，按体重随机分为5组，即正常组、模型组、四神丸组、加味四神丸组、柳氮磺吡啶对照组（阳性对照组）每组10只，适应性饲养3 d后用于实验。
       1.2  药物和试剂四神丸：由补骨脂，肉豆蔻，五味子，吴茱萸组成；加味四神丸由四神丸加桃仁、红花组成，药物购于江西中医学院附属医院，上药由江西中医学院药剂室制成含药2 g/ml及4 g/ml浸膏剂，4℃冰箱保存备用。柳氮磺吡啶每片0.25 g（上海三维制药有限公司生产，批号：002083）；葡聚糖硫酸钠（DSS）（美国sigma公司，批号：2508-19-2）。TNF-α、IFN-γ、IL-10、TGF-βELISA剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司产品，PAF-ELISA检测由南京建成生物工程研究所完成。
       1.3  仪器酶标仪（Thermo Multiskan MK3）；1575型洗板机（BIO-RAD制造）；BIOFUGE28RS型低温高速离心机（德国HERAEUS制造）；流式细胞仪（美国Coulter公司型号EPICS（XL）。
       2  方法
       2.1  造模［4］参考文献并加以改进，采用葡聚糖硫酸钠（DSS）灌胃法制作溃疡性结肠炎（UC）小鼠模型：将5%葡聚糖硫酸钠（DSS）0.8 ml灌胃，1次/d，同时自由饮含2% DSS水，连续7 d。
       2.2  给药自造模成功次日，按体表面积换算，四神丸组、加味四神丸组分别给予0.2 ml浸膏剂(含生药浓度分别为： 1 g/ml，2 g/ml)灌胃，阳性对照组予柳氮磺吡啶（SASP）混悬液0.2 ml（含药75 mg/ml），正常组及模型对照组均予等容量生理盐水灌胃，1次/d，共10 d。
       2.3  处理及观察给药10 d后，摘眼球取血，脱颈椎处死大鼠，迅速自肛门2 cm处向上分离结肠6～8 cm，称重后沿肠系膜纵轴剪开，用生理盐水冲洗干净，并将肠黏膜向上平铺于蜡板上固定，观察炎症及溃疡发生情况；根据炎症损伤程度进行结肠组织损伤评分。评分标准［5］：无损伤0分；黏膜充血、水肿、未出现溃疡为1分；黏膜充血、水肿、轻度糜烂、无溃疡为2分；黏膜充血、水肿、中度糜烂、有单个溃疡为3分；黏膜充血、水肿、高度糜烂、有多处溃疡为4分；黏膜充血、水肿、重度糜烂、有1 cm以上溃疡为5分。剪取部分结肠组织，10%福尔马林溶液固定，病理切片，HE染色，光镜下观察溃疡生成情况；部分结肠组织迅速于液氮中保存，待用于检测细胞凋亡水平和细胞因子的表达。病理组织学评分标准［6］：① 受累区域百分率；②滤泡聚集数目；③水肿；④糜烂／溃疡；⑤隐窝丢失；⑥单核、多核细胞浸润。① 和⑤分为5级：0分正常；1分<10％ ；2分10％ ；3分10％ ～50％ ；4分>50％ 。④糜烂分为4级：0分上皮完整；1分固有层受累；2分溃疡累及黏膜下层；3分溃疡透壁。② 和③ 、⑥则分为：0分无；1分轻度；2分中度；3分重度。将上述各项得分相加为病理组织学评分。同时计算各组各鼠结肠指数，结肠指数（％）=结肠重量/体重×100％，以考察结肠水肿等炎症表现。
       2.4  流式细胞术检测细胞凋亡水平将冻于液氮中的结肠块用眼科弯剪刀放在60 μm孔径的尼龙网上剪碎,用PBS冲下，收集成单细胞，细胞用95%乙醇固定，上机前用清洗1次，1 500 r/min离心5 min；弃上清液。加曲通1 ml，室温下静置10 min，离心1 500 r/min，弃上清液。加PBS清洗1次，弃上清液，加PNASE酶1 ml，37℃水浴恒温箱振荡10 min，1 500 r/min离心；弃上清液，加碘化丙啶(propridium 10 dide)1ml染色，用孔径60 μm的尼龙网过滤后，存放在4℃冰箱内20 min上机检测。
       2.5  酶联免疫吸附法检测结肠局部细胞因子水平参照试剂盒的说明书检测外周血血小板活化因子（platelet activating factor, PAF）表达水平及结肠组织匀浆中TNF-α，IL-10，TGF-β的含量。使用现成包被好的试剂，向96孔板中分别加入100 μl的待测上清液和标准品，室温下孵育2 h，加入100 μl的检测抗体，室温下孵育1 h，用缓冲液洗5次，加入100 μl的辣根过氧化物酶标记的亲合素，室温下孵育30 min。用洗涤缓冲液洗5次，加入100 μl TMB底物，室温孵育15 min后，加入50 μl终止液，用酶标仪于波长450nm测定吸光度值。
       2.6  统计学方法采用SPSS11.5软件进行统计学处理，各组数据进行正态检验及方差齐性检验，采用方差分析。
       3  结果
       3.1  病理学观察及结肠损伤评分见表1。肉眼下可见模型组结肠黏膜明显充血、水肿，中到重度糜烂和多个溃疡，溃疡呈圆形或椭圆形，底部干净，或可见少量淡黄色覆盖物，边缘充血水肿；镜下可见黏膜糜烂脱落、充血水肿，炎症细胞浸润，形成多个溃疡缺损，结肠指数、结肠损伤评分及病理组织学评分明显高于正常组（P＜0.01）；各治疗组亦可见少量充血水肿和部分结肠可见轻度糜烂和溃疡，镜下可见溃疡数目明显减少，底部可见纤维结缔组织增生，充血水肿明显减轻，伴少量炎症细胞浸润，与模型组比较结肠指数、结肠损伤评分及病理组织学评分明显下降并具有统计学意义（P＜0.05）。同时，四神丸与加味四神丸两组之间比较无显著性差异，提示四神丸及加味四神丸均可明显缓解结肠损伤局部充血水肿，减轻炎症细胞浸润程度，减少溃疡数目，促进结肠上皮损伤修复、溃疡愈合。表1  结肠黏膜损伤修复情况（略）与正常组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05；与四神丸组比较,*P＜0.05；n=10
       3.2  结肠上皮细胞凋亡情况见表1。结肠上皮细胞凋亡水平可见模型组较正常组明显升高（P＜0.01），而各治疗组与模型组比较，其结肠上皮细胞凋亡率明显下降（P＜0.01或P＜0.05）。同时加味四神丸组与四神丸之间比较，加味四神丸降低结肠上皮细胞凋亡率明显优于四神丸(P＜0.05），提示四神丸及加味四神丸均可明显抑制结肠上皮细胞凋亡速度，减轻损伤程度，且加味四神丸优于四神丸组。
       3.3  结肠局部细胞因子表达水平见表2。结肠局部组织匀浆细胞因子水平可见，模型组TNF-α，PAF表达水平明显高于正常组（P＜0.01或P＜0.05），而IL-10，TGF-β表达水平均明显低于正常组，给药10 d后，与模型组比较，四神丸组明显升高TGF-β水平外（P＜0.01），对TNF-α，PAF，IL-10表达作用不明显，或仅有作用趋势，而无统计学意义。而加味四神丸与模型组比较，降低TNF-α，PAF表达、升高TGF-β水平较明显（P＜0.01或P＜0.05），同时，四神丸与加味四神丸之间比较，可见加味四神丸降低TNF-α，PAF表达，升高IL-10水平明显优于四神丸组（P＜0.05），但升高TGF-β水平则无统计学意义。
       4  讨论
        溃疡性结肠炎是一种不明病因的炎症性结肠疾病。宏观上，几乎各种证型都不同程度存在着淤血状态；微观上，均有血液流变学的改变［7］。王长洪提出UC病人不论病史长短、症状轻重、缓解或发作，主诉均为腹痛、腹泻、黏液脓血便，结肠镜检查黏膜充血、水肿，甚至出现糜烂、溃疡、出血，肠黏膜活检病理组织学常见大量血栓形成，均与中医的“血淤”之证吻合，强调UC总的病机特点应归纳为“淤滞”，病理特征是虚中夹实，并贯穿于疾病的全过程［8］。根据久病成虚和久病成淤的理论，UC日久，其病机发展以脾肾亏虚为本的病理状态，同时兼夹淤血凝滞，故而治疗上可见温补脾肾法和活血化淤法联合使用。如何胜国等［3］采用温阳活血法治疗非特异性UC患者34例，结果有效率为97.06%，效果显著。表2  结肠组织匀浆细胞因子的表达（略）与正常组比较，★★P＜0.01，★P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05；与四神丸组比较,*P＜0.05；n=10
        现代研究表明，溃疡性结肠炎患者体内存在血液高凝状态［9］，提示高凝状态的形成可能是UC的重要发病特征之一。溃疡性结肠炎患者外周血和患病局部均存在血液浓稠性、聚集性、黏滞性增高，血液循环减慢，导致肠黏膜血液灌流减少，细胞缺血、缺氧，进而引起肠黏膜组织损伤［7］。高凝状态的形成与PAF（Platelet Activating Factor，PFA）的活化有密切的关系，PAF在溃疡性结肠炎的发病过程中起关键性作用，可潜在性刺激前炎症因子的产生和增加炎症细胞［10］。Ko等［11］研究发现，PAF与靶细胞表面受体结合后激活核因子NF-κB而上调IL-1，TNF-α的合成和分泌。IL-1，TNF-α作为一级炎症因子，又刺激多种炎症细胞合成PAF。PAF还可显著性促进CD4T细胞增殖，调节T淋巴细胞亚群之间的平衡，趋化T淋巴细胞，且可降低SIgA水平，损害肠黏膜的免疫屏障功能［12］。CD4T细胞已经被确定作为溃疡性结肠炎的致病性T细胞，它是通过Th1或Th2通路引发肠道炎症的［13］。前者能产生大量的IL-2，IFN-γ等；后者Th2细胞则可产生IL-4，IL-5等细胞因子，从而活化B细胞，产生中和抗体和IgE。血小板活化因子激活后，释放或促进大量炎症因子的分泌，引起血小板的黏附和聚集，或作为炎症介质，或调节免疫功能，直接或间接参与肠道黏膜的损伤，最终引起UC患者体内血液的高凝状态的形成，因此，PAF广泛的参与了溃疡性结肠炎的多个发病关键环节，形成以血小板活化因子为中心，以炎症介质、免疫异常为网络，导致高凝状态，引起结肠局部血管内皮损伤，结肠局部组织细胞缺血缺氧，最终导致结肠黏膜变性坏死，形成溃疡。
        本实验中，模型组TNF-α、PAF表达水平明显高于正常组，而IL-10、TGF-β表达水平均明显低于正常组，与相关报道较一致。加味四神丸则可显著降低TNF-α、PAF表达、升高TGF-β水平较明显，表明活血理肠丸可能抑制血小板活化因子的活化，进而调节抗炎因子和促炎因子平衡，减轻炎症损伤，促进黏膜修复、溃疡愈合。而四神丸则明显升高TGF-β表达水平，表明四神丸可有效治疗溃疡性结肠炎的途径可能是通过升高TGF-β表达水平，由此抑制单核细胞及T细胞等细胞的活性，减少TNF-a等促炎因子的分泌，促进上皮细胞修复，减少上皮细胞凋亡的速度，加速溃疡愈合。二者均有效治疗溃疡性结肠炎，但二者作用的可能机制不同，临床使用时宜根据患者血凝状态程度和辨证论治加以选择。
       【参考文献】
         　　［1］郭建鹏.溃疡性结肠炎的中医药治疗研究进展［J］ 时珍国医国药，2006,17(8):1576.
       
       ［2］陆宇平,王长洪. 活血化瘀法在治疗溃疡性结肠炎中的应用［J］中华中医药学刊，2008,5(26):970.
       
       ［3］何胜国, 张笑平.温阳活血法治疗非特异性溃疡性结肠炎34例近远期疗效观察［J］.安徽中医临床杂志，2001,13(4):262.
       
       ［4］张志军, 刘 懿, 王 磊, 等.TLR4mAb对急性期溃疡性结肠炎小鼠结肠粘膜中促炎因子的影响［J］. 复旦大学学报（医学版），2008,35(2):176.
       
       ［5］Duan-Yong Liu, Hai-Mei Zhao, Ning Zhao, et al. Pharmacological effects of Ba-Wei-Xi-Lei powder on ulcerative colitis in rats with enema application ［J］. American Journal of Chinese Medicine，2006,34( 3):461.
       
       ［6］石忠峰, 陈蔚文, 李茹柳, 等. 白术黄芪汤及其有效部位组方对小鼠溃疡性结肠炎的疗效观察［J］. 中药新药与临床药理，2007,18(2):87.
       
       ［7］张 理，黄发盛.宏观与微观结合论治溃疡性结肠炎血痕证［J］.光明中医，2004, 19(4):22.
       
       ［8］王艳红, 郝 震, 赵聪林.王长洪教授活血化疲法治疗溃疡性结肠炎经验［J］. 中医药学刊，2005,24(1):32.
       
       ［9］白爱平，欧阳钦，余世南，等.活动性溃疡性结肠炎患者外周血血小板功能及免疫球蛋白水平的研究［J］.四川医学,2003,24(6):555.
       
       ［10］Hirayama K, Yokoi Y, Sakaguchi, et al. Platelet-activating factor, a critical mediator in the pathogenesis of dextran sulfate sodium-induced colitis in rats［J］. Dis Colon Rectum,2003,46(1):100.
       
       ［11］Ko HM，Seo KH，Han SJ．Nuclear factor kappa B dependency of platelet-activating factor -induced angiogenesis［J］. Cancer Res,2002,62:l809.
       
       ［12］王丽杰，刘冬妍，孙 梅，等.血小板活化因子对幼鼠肠道免疫屏障功能的影响［J］ 世界华人消化杂志，2005, 13 (18): 2266.
       
       ［13］Bhan AK, Mizoguchi E, Smith RN, et al. Colitis in transgenic and knockout animal as model of human inflammatory bowel disease ［J］. Immunol Rev, 1999,169:195.