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       【摘要】 
       目的研究针药结合治疗对实验性糖尿病性周围神经病变(DPN) 的防治作用。方法采用随机分组设计，将大鼠分为模型组、电针组、穴位注射组、针药结合组，运用链脲佐菌素造成实验性DPN大鼠模型，用神经电生理方法观察坐骨神经传导速度，用电镜观察神经纤维的超微结构。结果针药结合治疗组与模型组、电针组、穴位注射组相比，感觉传导速度(SNCV)、运动传导速度（MNCV）均有所改善(P<0.05)，但未达到正常组的水平；针药结合治疗组大鼠坐骨神经轴突变性、脱髓鞘程度有所减轻。结论针药结合治疗法对实验性糖尿病周围神经病变具有一定的防治效果。
       【关键词】  糖尿病周围神经病变 坐骨神经传导速度 针药结合
        糖尿病周围神经病变（diabetic peryneuropathy, DPN）是糖尿病常见的慢性并发症和主要的致残因素之一。目前尚无特效治疗方法治疗糖尿病周围神经病，以往在临床中用针药结合治疗DPN取得了较好的临床疗效［1］。本实验通过观察针药结合治疗对糖尿病大鼠坐骨神经结构和神经传导速度的影响，验证针药结合治疗对糖尿病周围神经病变的防治作用。
       1  材料与仪器
       1.1  动物选用4月龄健康雄性清洁级Wistar大鼠90只，体重200～220 g，购自中国科学院上海动物实验中心（许可证号码：SCXK(沪)2003－0003）。常温常湿环境中饲养。
       1.2  药物与试剂链脲佐菌素（STZ）购自美国Sigma产品，批号S-0130；柠檬酸、柠檬酸三钠、水合氯醛、甲醛、多聚甲醛购自上海试剂一厂；雪莲注射液：新疆中药厂第二分厂生产。
       1.3  仪器电子天平，上海天平仪器厂出品；强生稳豪型血糖仪，上海强生公司出品；神经电生理检测仪，Medtronic, Keypoint, Denmark；DK-8D型电热恒温水槽，上海医用恒温设备厂出品；石蜡切片机，德国Lico公司 RM2145 KON；透射电镜，日立H-600。
       2  方法
        完全随机分组设计，对照实验。
       2.1  动物模型制备及分组造模前大鼠禁食过夜，次日用STZ（STZ溶于0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，冰浴中新鲜配制）按55 mg/kg 剂量腹腔内一次注射（参照施新猷《医学动物实验方法》）诱导糖尿病。1周后，用血糖仪测定尾尖血血糖，测血糖前禁食过夜，血糖 ≥15 mmol/L判定为糖尿病鼠。实验前监测血糖，血糖＜15 mmol/L的大鼠予以剔除。正常对照大鼠仅腹腔注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。常规喂养4周，随机选取10只DM大鼠，进行血糖、体重、温度阈值和神经传导速度检测，与造模前大鼠比较以空腹血糖≥15 mmol/L、坐骨神经SNCV、MNCV明显减慢、摆尾温度阈值升高及坐骨神经有髓纤维形态学改变，为实验性DPN大鼠模型。
        造模成功后，按随机数字表法随机分为模型组、电针组、穴位注射组、针药结合组，每组15只。正常组与模型组不作任何治疗，电针组、穴位注射组和针药结合治疗组给予相应治疗，剩余大鼠备用。
       2.1.1  电针组（15只）取穴：肾俞（双）、足三里（双）。穴位定位参照《实验针灸学》［2］。接G6805-Ⅱ型电针治疗仪，连续波，频率2 Hz，电流强度以刺激部位皮肌微颤为度，20 min/次，1次/2 d，共治疗12次。
       2.1.2  穴位注射组（15只）用雪莲注射液于上述穴位注射，每次轮换取1穴，每穴0.1 ml，治疗次数同上。
       2.1.3  针药结合组（15只）具体方法和治疗次数先同电针组，起针后治疗再同穴位注射组。
       2.1.4  模型对照组（15只）不作任何治疗，只作与治疗组相同的固定。
       2.1.5  正常对照组（15只）选正常Wistar大鼠，作与治疗组相同的固定。
       2.2  指标检测
       2.2.1  一般项目观察各组大鼠造模前及造模后4周、8周的血糖、体重变化。
       2.2.2  摆尾温度阈值造模前及造模后4周、8周将鼠尾浸入水中约2 cm，当水温增高而尾摆动并露出水面时记录水温，此时水温为摆尾温度阈值(Tailflick Threshold Temperature，TTT)。
       2.2.3  电生理测定造模前及造模后4，8周，用10％水合氯醛将大鼠麻醉，在麻醉状态下用神经电生理检测仪检测大鼠右侧坐骨神经传导速度。
        运动神经传导速度检测（MNCV）：第1刺激部位在坐骨窝，第2刺激部位在踝部内侧，均用两个针电极经皮插入，电极间距为2 mm，接地于尾部，保持皮温30℃，用方形波（10～20mA，40μs脉波宽）刺激神经,用两个针电极在同侧的足部第2趾骨间肌记录复合肌肉动作电位，记录3对不同M波的潜伏期,取平均值，近端和远端潜伏期作为运动神经在两个刺激部位间的传导时间，用弯角规测量两个刺激部位间的距离。
        感觉神经传导速度检测（SNCV）：第1刺激部位在坐骨窝，第2刺激部位在踝部内侧，均用2个针电极在第2趾骨间肌经皮插入， 电极间距为2 mm,接地于尾部。保持皮温30℃，用方形波（2 mA，40 μs脉波宽）记录6个在坐骨窝和踝部激发H反射潜伏期，取最短潜伏期差值，用弯角规测量两个刺激部位间的距离。SNCV（m/s）= 距离/潜伏期差值。
       2.2.4  坐骨神经形态学观察水合氯醛将大鼠麻醉，无菌操作取模型组、3组治疗组大鼠和正常组大鼠左侧坐骨神经，取梨状肌下缘坐骨神经约0.1 cm，放入2.5%戊二醛溶液中固定2 h后，冲洗、1%锇酸固定液固定、乙醇和丙酮梯度脱水，然后用1∶1包埋剂和100%丙酮浸透2 h，再放入包埋剂中浸透2 h，放入聚合器中进行聚合，使用LKB-V切片机进行切片，用醋酸铀染色30 min，柠檬酸铅染色15 min，使用日立H-600电镜进行电镜观察。
       2.3  统计分析采用SPSS11.0统计软件进行统计学分析。计量结果以±s表示，计量资料差异比较采用方差分析和q检验。
       3  结果
       3.1  各组大鼠一般情况观察
       3.1.1  各组大鼠体重对比观察(见表1)。各组大鼠造模前体重比较无显著性差异（P>0.05）。造模4周后，模型组、电针组、穴位注射组、针药结合组大鼠体重下降，与正常组比较具有显著性差异（P<0.01）。模型组、电针组、穴位注射组、针药结合组治疗前后体重无显著性差异（P>0.05），正常组8周后体重增加，与4周比较具有显著性差异（P<0.01）。表1  各组大鼠体重对比观察（略）4周与正常组比较，*P<0.01；8周与4周比较，△P<0.01
       3.1.2  各组大鼠血糖对比观察见表2。各组大鼠造模前血糖比较无显著性差异（P>0.05）。造模4周后，模型组、电针组、穴位注射组、针药结合组与正常组比较具有显著性差异（P<0.01）。8周后电针组、穴位注射组、针药结合组与模型组比较无显著性差异（P>0.05）。表2  各组大鼠血糖对比观察（略）　4周与正常组比较，*P<0.01；8周与4周比较，△P<0.01
       3.1.3  各组大鼠摆尾温度阈值对比观察见表3。各组大鼠造模前温度阈值比较无显著性差异（P>0.05）。造模4周后，模型组、电针组、穴位注射组、针药结合组大鼠摆尾温度阈值升高，与正常组比较具有显著性差异（P<0.01）。电针组、穴位注射组、针药结合组治疗后，大鼠摆尾温度阈值降低。电针组、穴位注射组、针药结合组治疗后与模型组8周后比较具有显著性差异（P<0.01），针药结合组与穴位注射组、电针组治疗后组间比较具有显著性差异（P<0.01）。表3  各组大鼠摆尾温度阈值观察（略）4周与正常组比较，*P<0.01；8周与4周比较，△P<0.01
       3.2  各组大鼠神经传导速度比较见表4。8周后，模型组、电针组、穴位注射组、针药结合组与正常组比较MNCV降低，均具有显著性差异（P<0.01）；模型组、电针组、穴位注射组、针药结合组与正常组比较SNCV降低，均具有显著性差异（P<0.01或P<0.05）；电针组、穴位注射组、针药结合组与模型组比较MNCV、SNCV升高，具有显著性差异（P<0.01）；电针组与穴位注射组MNCV、SNCV比较，无显著性差异（P>0.05）；针药结合组与电针组、穴位注射组MNCV、SNCV比较，有显著性差异（P<0.05）。证实电针、穴位注射、针药结合对DPN大鼠周围神经病变MNCV、SNCV具有良好的调整作用，使减慢的运动和感觉神经传导速度均提高，针药结合组治疗效果优于电针组、穴位注射组。表4  各组大鼠治疗后神经传导速度比较（略）与正常组比较，*P<0.01，**P<0.05；与模型组比较，△P<0.01；治疗组间比较，▲P<0.05，▲▲P>0.05；n=15
       3.3  各组大鼠坐骨神经超微结构变化正常组(图1a，b横切面)：有髓神经纤维髓鞘致密、均匀、结构完整、规则、髓鞘板层呈同心圆状排列，轴索无萎缩及肿胀。模型组(图1c，d，横切面)：大鼠坐骨神经有髓神经纤维髓鞘结构模糊、松散、排列紊乱，出现空泡状缺损，板层间隙扩大、板层分离。电针组(图1e，f横切面)：大鼠坐骨神经有髓神经纤维的髓鞘结构趋完整态规则，空泡状缺损减少，结构排列较整齐，轴索无明显肿胀。穴位注射组(图1g，h横切面)：大鼠坐骨神经有髓神经纤维髓鞘结构松散，有空泡状缺损，板层间隙扩大、板层分离。针药结合组(图1i，j横切面)：大鼠坐骨神经有髓神经纤维的髓鞘结构趋完整态规则，结构排列较整齐，空泡状缺损明显减少，轴索无明显肿胀。
       
       4  讨论
        糖尿病（DM）已成为严重威胁人类健康和生命的常见病、多发病，糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy, DPN）是糖尿病的最常见的慢性并发症和主要的致残因素之一。是在DM的基础上发生所引起的一种疾病，是由代谢紊乱和供血障碍为主综合作用的结果［3～5］，临床呈对称性疼痛和感觉异常，下肢症状较上肢多见。
        神经传导速度是检测糖尿病神经功能最常用指标，它主要代表大的有髓纤维的功能。神经传导速度减慢是糖尿病出现神经病变的一个先兆。临床上许多DPN病人在出现明显的运动、感觉障碍之前已有明显的神经传导速度减慢［6］。在实验性DPN研究中也发现，STZ诱导的糖尿病大鼠在糖尿病早期坐骨神经MNCV、SNCV显著减慢，并随病程延长进一步减慢［7］。我们观察发现，DPN大鼠造模4周后，神经传导速度MNCV和SNCV明显减慢，治疗后电针组、穴位注射组、针药结合组神经传导速度MNCV和SNCV与模型组比较均有显著提高，治疗组组间比较，针药结合组对MNCV和SNCV调节疗效优于电针组、穴位注射组，提示针药结合对改善糖尿病周围神经病变的试剂传导速度具有一定作用，其作用优于单用电针及穴位注射治疗。
        糖尿病周围神经病变时神经功能的改变先于并伴随神经解剖损害的发展，而神经病理形态学观察可以微观地反映神经结构受损的部位、性质和程度，阐明其影响神经功能的内机制。临床上糖尿病患者并发周围神经病变时，在神经传导速度出现减慢的同时，往往伴有神经纤维组织脱髓鞘改变及轴索不同程度的损害，主要表现为髓鞘肿胀、脱失，轴索变性、萎缩，有髓纤维丧失和神经再生障碍［8，9］。本研究发现，糖尿病大鼠4周时，坐骨神经均有明显的形态学改变，以髓鞘结构模糊、松散、排列紊乱，出现空泡状缺损，板层间隙扩大、板层分离为特点，治疗后针药结合组的大鼠坐骨神经髓神经纤维的髓鞘结构排列较整齐，空泡状缺损明显减少，明显改善髓鞘组织结构，且作用优于电针组、穴位注射组，提示其对坐骨神经有一定的修复作用。
        DPN的主要临床表现是在DM的症状基础上又见肢体麻木、疼痛、无力、肌肉萎缩等，与中医“痹证”“痛证”“痿证”描述相似［10］。DPN的病位在经络，与肾的关系最为密切，病变的性质为本虚标实，虚实夹杂之证。DPN的病变过程是一个由虚致衰、或由虚致实，渐至虚实夹杂、病情渐重的发展演变过程。肾阴、肾气、肾阳的虚衰性改变和经络生理功能的渐进性受损始终是这一过程中病机的主导方面，它决定DPN症状构成。针药结合治疗糖尿病周围神经病变主要立足于辨证论治，从整体出发，疏通经络、调和脏腑、益气活血，作用于DPN致病因素的众多环节，标本兼治，在多层次上发挥作用。
        综上所述，糖尿病大鼠早期即并发神经病变，其损伤程度随病程而加重。糖尿病4周大鼠已有明显的神经功能障碍并出现形态学改变，表明STZ诱导的糖尿病大鼠病程4周时已并发DPN。DPN 以“肾之气阴两虚” 为发病基础，以“肾之阴阳两虚，经络涩滞不畅” 为病机本质，“根据治病必求于本”，治疗调补肾之阴阳、疏通经络气血，选取肾俞、足三里穴及药物雪莲穴位注射具有益气养阴、活血通络、扶正补虚的作用，实验研究结果证实了肾俞、足三里联合药物雪莲穴位注射具有良好的防治糖尿病周围神经病变的作用，疗效优于单用电针及穴位注射治疗，为临床针药结合治疗DPN的奠定了一定的实验基础。
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