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       【摘要】 
       目的考察732型阳离子交换树脂分离猫豆中猫豆胍(MDG)的工艺参数。方法以猫豆胍洗脱率为考察指标，运用正交实验法考察了洗脱液浓度、用量和洗脱速度对洗脱效果的影响。结果在考察范围内，最佳分离条件为：150倍量1%氨水，洗脱速度5.0 ml/min。在优化条件下，洗脱率为60.94%。结论该工艺方法简单，成本低廉，适于工业大生产。
       【关键词】  猫豆; 猫豆胍; 离子交换; 阳离子树脂; 分离纯化
       Separation of MDG from the Seed of Stizolobium cochinchinensis by 732 Cation Exchange Resin
       HUANG Zengqiong1,2, JIANG Weizhe1*, HUANG Xingzhen1, LU Lu1, WU Shihong1
       (1. Pharmaceutical School of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China; 2. Pharmacological Department of Youjiang Medical College for Nationality, Baise 533000, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the process parameters of MDG separated from the seed of Stizolobium cochinchinensis by 732 cation exchange resin.MethodsThe orthogonal test was adopted to study the eluting effect of MDG with the elution rate as an index, and concentration of eluant, amount, elution velocity as the influence factors. ResultsThe results showed that the best separating conditions were 150 times of 1% ammonia hydrate as eluant, and the elution velocity was 5.0ml/min. Under the optimal conditions, the elution rate was 60.94%. ConclusionThe separated procedure is simple, the cost is low,and it is suited for industial produce.
       Key words：The seed of Stizolobium cochinchinensis; MDG; Ion exchange; Cationic resin; Separation and purification
       猫豆又名猫爪豆、狗爪豆、白藜豆、龙爪豆，是豆科植物龙爪藜豆Stizotobium cochinchinensis (Lour). Tang et Wang的种子[1]，广西是最主要的产区。猫豆中主要成分为左旋多巴，是国内提取左旋多巴最主要的原料药材。笔者采用制备液相色谱层析系统AKTA Explorer 100从猫豆中提取分离得到一种单体成分，经化学结构鉴定，该成分为首次从猫豆中分离获得，暂命名为猫豆胍[2]。药理学研究表明，该化合物具有一定的镇静催眠作用。为了更好地利用猫豆中的猫豆胍，提高猫豆的综合利用率，改变猫豆单一提取左旋多巴的生产模式，探寻适合工业化生产猫豆胍的工艺，本文对732型阳离子交换树脂分离猫豆胍的工艺条件进行了探索和优化。
       1 仪器与材料
       LC-9000D高效液相色谱仪(南宁市威玛龙色谱科技有限公司);Sartorius ME215S1/100000电子天平(北京赛多丽斯仪器系统有限公司)。
       猫豆胍对照品(广西医科大学新药研究开发中心制备提供，纯度99.54%);猫豆(广西邦尔植物制品有限公司，经右江民族医学院附属医院刘春荣副主任中药师鉴定);甲醇(色谱纯，TEDIA COMPANY);732型阳离子交换树脂(中国医药集团上海化学试剂公司)。
       2 方法与结果
       2.1 上柱液的制备取猫豆药材，破碎，用5倍量0.1 mol/L盐酸浸泡1 h，再以15倍量相同浓度的盐酸溶液渗漉提取，渗漉速度5 ml/min，过滤，滤液浓缩至适当体积，即得猫豆上柱液，备用。
       2.2 猫豆胍含量的测定方法[3]采用HPLC法测定。色谱柱Phenomenex TM C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相0.1 mol/L冰醋酸-甲醇(95:5)，流速1.0 ml/mim，检测波长320 nm，柱温25℃，进样量20 μl。
       标准曲线：取猫豆胍对照品约5 mg，精密称定，置50ml量瓶中，加0.1 mol/L冰醋酸溶解并定容，得猫豆胍对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液0.5，1，2，4，8 ml，分别置于10 ml量瓶中，加0.1 mol/L冰醋酸至刻度，摇匀，制成系列浓度的对照品溶液。分别进样测定。以对照品进样量(μg)为横坐标(X)，猫豆胍峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得标准曲线方程为：Y= 2 000 000X-3 547.4，r=0.999 9。结果表明猫豆胍进样量在0.118～1.888 μg范围内线性关系良好。
       2.3 树脂的选择和预处理猫豆胍为生物碱类化合物。根据其理化性质及左旋多巴大生产实际，考虑选用与猫豆分离左旋多巴相同的732型强酸性阳离子交换树脂对猫豆胍进行分离。
       取一定量的732型强酸性阳离子交换树脂，用蒸馏水漂洗至排水澄清为止，蒸馏水浸泡24 h，使其充分膨胀;用树脂体积4倍量的2 mol/L盐酸溶液浸泡、搅拌2 h，蒸馏水洗至中性;再用树脂体积4倍量的2 mol/L氢氧化钠溶液浸泡、搅拌2 h，蒸馏水洗至中性;最后用树脂体积4倍量的2 mol/L盐酸溶液浸泡、搅拌2 h，蒸馏水洗至中性，备用。
       2.4 静态吸附实验[4]取经预处理的树脂1 g，加入猫豆上柱液10 ml(猫豆胍浓度为0.058 8 mg/ml)，在0，1，3，6，9，16，18，20 h时分别取上清液，测定猫豆胍的浓度。树脂的静态吸附量q=Δc·V/W，式中Δc为吸附后浓度与吸附前浓度差值，V为上柱液体积，W为湿树脂重。
       静态吸附曲线(见图1)。由图1可知，树脂吸附16 h后基本达到饱和吸附，此时，静态吸附量为0.526 5 mg/g湿树脂。
       2.5 动态吸附实验[5～7]取适量经预处理的732型阳离子交换树脂(树脂床体积为30 ml，径高比为1∶9)，湿法装柱。取“2.1”项下上柱液(猫豆胍浓度为0.496 4 mg/ml)，上柱交换，交换速度1 ml/min，每10 ml一管收集流出液，分别测定各管流出液中猫豆胍的浓度。以流出液体积为横坐标，流出液中猫豆胍的浓度为纵坐标，绘制穿透曲线(见图2)，计算树脂的动态饱和吸附量。
       饱和吸附量=上柱液浓度×V-(各收集管浓度×10)树脂体积
       式中，V为上柱液体积。
       由图2可见，当流出液体积为500 ml左右时，猫豆胍开始出现较大泄漏。当流出液体积达到590 ml时，树脂对猫豆胍的吸附趋于饱和。此时，树脂对猫豆胍的动态饱和吸附量为9.76 mg/ml湿树脂，即猫豆胍的上柱量约为10倍树脂床体积较适宜。经测定，猫豆药材中猫豆胍的含量为0.35%，因此，732型阳离子交换树脂对猫豆药材的处理量为2.8 g生药/ml湿树脂。
       2.6 732型阳离子交换树脂分离猫豆中猫豆胍的工艺优选根据预实验结果，发现洗脱剂用量(A)、洗脱剂浓度(B)和洗脱速度(C)这3种因素对洗脱率的影响较大。因此，采用正交设计实验，以猫豆胍的洗脱率为指标，考察这3种因素的影响，按表1安排实验。
       按“2.5”项下方法装柱(树脂床体积为95 ml，径高比1∶15)。取已知猫豆胍浓度的猫豆上柱液10 ml上柱交换，交换速度控制在1 ml/min，蒸馏水洗至中性，氨水作为洗脱剂洗脱。收集洗脱液，分别测定洗脱液中猫豆胍的浓度，计算洗脱率。对实验结果进行方差分析。结果见表2。
       洗脱率(%)=洗脱液浓度×洗脱液体积上柱液浓度×上柱液体积×100%　表1 正交实验因素水平表2 方差分析结果
       结果表明，以洗脱率为指标，影响因素A>B>C，即洗脱剂用量对实验结果的影响最大，差异具有显著性，洗脱剂浓度影响次之，洗脱速度对洗脱率影响不大。因此，在考察范围内，732型阳离子交换树脂对猫豆胍的分离最佳水平组合为A3B3C1，即洗脱剂为150倍量5%氨水，洗脱速度2 ml/min为最佳分离工艺条件。由于洗脱剂浓度与洗脱速度对结果的影响差异无显著性，考虑到提高效率，节约成本及劳动保护等生产实际，建议采用A3B1C3的分离工艺，即洗脱剂为150倍量1%氨水，洗脱速度5 ml/min。按此工艺重复实验3次，平均洗脱率为60.94%。
       2.7 树脂的再生使用后的树脂，可用蒸馏水反冲至中性，再用2 mol/L盐酸溶液浸泡2 h，然后用树脂体积4倍量的2 mol/L盐酸溶液淋洗，蒸馏水洗至中性;用2 mol/L氢氧化钠溶液浸泡2 h，再用树脂体积4倍量的2 mol/L氢氧化钠溶液淋洗，蒸馏水洗至中性。再次使用时，用树脂体积4倍量的2 mol/L盐酸溶液淋洗使树脂转型，蒸馏水洗至中性，备用。经再生的树脂可重复使用。
       3 讨论
       实验中曾对不同洗脱剂进行选择，发现碱性洗脱剂如氨水和氢氧化钠，都可作为洗脱溶剂，其洗脱效果较酸性溶剂好。以氢氧化钠作为洗脱剂，洗脱液中杂质较多，使后续的纯化工作难度增加，且生产成本较氨水高。以低浓度的氨水为洗脱溶剂，洗脱液中杂质较少，所得样品纯度较高，便于纯化，故选用氨水作为洗脱溶剂。
       采用732型阳离子交换树脂对猫豆胍进行分离，以1%氨水作为洗脱溶剂，能将吸附在树脂上的左旋多巴也洗脱下来，且洗脱剂浓度越大，越容易被洗脱。采用HPLC法对洗脱液中的左旋多巴和猫豆胍进行监测。当洗脱剂用量达到上样体积的30倍时，左旋多巴已经基本完全被洗脱，而猫豆胍只有少量被洗脱。当用量达到180倍时猫豆胍的洗脱已较完全。150倍量时，猫豆胍的洗脱量已占180倍时洗脱总量的89.5%。提高氨水浓度虽能减少洗脱剂用量，提高洗脱速度，但浓度太大，氨水刺激性强，不利于劳动保护。因此，以150倍量1%氨水进行洗脱比较经济、科学、安全。
       采用732型阳离子交换树脂可实现对左旋多巴和猫豆胍的同时分离，分离效果好，分离得到的猫豆胍纯度达到67.83%，且树脂可再生重复利用，适于工业大生产。
       【参考文献】
         　　[1] 江苏新医学院.中药大辞典，第1版，上册[M].上海:上海科学技术出版社,1977：1423.
       
       [2] 广西医科大学.一种生物碱类化合物及其制备方法和用途[P].中国专利:CN101318937,2008，12：10.
       
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