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       【摘要】 
       目的优选锁阳中黄酮的最佳提取工艺。方法分别以总黄酮含量、浸膏得率、儿茶素含量和抗自由基活性为评价指标，选择物料比(A)、提取时间(B)和提取次数(C)为考察因素, 采用正交实验L9 (34)优选锁阳中黄酮的最佳提取工艺。结果锁阳中黄酮的最佳提取工艺条件为：以60 %的乙醇为提取溶剂, 物料比为1∶14 , 提取时间3.0 h , 共提取1 次。结论优选工艺条件可为新药研究和工业化生产提供参考。
       【关键词】  锁阳; 正交实验; 提取工艺; 总黄酮; 儿茶素; 清除自由基活性
       Study on Extraction Process of Flavonoids in Cynomorium songaricum Rupr
       MENG Min1,2, LIU Ye-wei3, HE Dian1*, DI Duolong1,2**
       (1. Pharmacological School, Lanzhou University, Lanzhou, 730000, China; 2. Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou, 730000, China; 3. Public Health School , Lanzhou University , Lanzhou 730000 , China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the optimum ethanol extraction process conditions for the flavonoids in Cynomorium songaricum Rupr. MethodsThe content of total flavonoids and catechin , extraction rate, free radical scavenging activity were chosen as the assessment indices. With the solid-liquid ratio, reflux time and extraction time as investigation factors, the optimum ethanol extraction process of the flavonoids from Cynomorium songaricum Rupr was determined by L9 (34) orthogonal experimental design. ResultsThe optimum extracting conditions was selected as follow: the ratio of raw material to 60% alcohol was 14∶1, the reflux time was 3 hours, and extraction times was one.ConclusionThe optimum extraction process can give a reference to the research of a new medicine and industry production.
       Key words： Cynomorium songaricum Rupr.; Orthogonal experiment; Extraction technology; Total flavonoids; Catechin; Free radical scavenging activity
       锁阳 Cynomorium songaricum Rupr.为锁阳科 Cynomoiraceae锁阳属寄生植物锁阳的干燥肉质茎,常寄生于蒺藜科植物白刺Nitrariasibirica的根上，多生长于干旱与含碱的沙地,主产于内蒙古、宁夏、新疆、甘肃、青海等西北地区。锁阳味甘、性温，具有补肾、助阳、益精、润肠养筋之效用，中医用于治疗阳痿、遗精、不孕、腰膝酸软、肠燥便秘等[1]。现代药理学研究表明，锁阳具有提高机体免疫力、清除自由基、抑制人体免疫缺陷病毒(HIV) [2，3]、抑制血小板聚集和雌激素样[4]等多种药理活性。锁阳中的化学成分主要有有机酸、黄酮类、酚类 [5]、甾体类、三萜类 [6]、鞣质、糖苷等多种成分,其中黄酮类成分具有提高机体免疫力、清除自由基的活性[7]。因此，研究锁阳中黄酮的提取工艺技术，对于开发以锁阳为原料的具有提高机体免疫力、清除自由基活性的保健食品和中药新药具有重要意义。
       目前，中药提取工艺的评价，大多选择浸膏得率和化学成分提取率为评价指标筛选最佳工艺条件。由于中药是多组分复杂体系，起主要药理作用的化学成分尚不十分清楚,在研究工艺时选择一种或几种化合物作为提取工艺的评价指标,所得结果可能不全面。本文采用化学指标(浸膏中总黄酮含量)和生物学指标(抗自由基活性)相结合的方法，利用正交实验L9 (34) ，筛选锁阳黄酮最佳提取工艺，以期得出更切合实际的提取工艺条件。本研究经文献检索，未见同类文献报道。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器RE-52C 型旋转蒸发仪(巩义市英峪予华仪器厂);SHZ-D Ⅲ 型循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂);BS224S 型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);CH-8606 微量分析天平(瑞士梅特勒托利多公司);DZF-6050 真空干燥箱(巩义市英峪予华仪器厂);Agilent 1200 系列(Agilent Technologies, USA)，包括G1312A Binary pump， a G1315B DAD，G1328B Manual injector.，Agilent Chemstation software ;ODS-AP C18 ( 250 mm × 4.6 mm, i.d. , 5 μm;大连依利特分析仪器有限公司);T6 新世纪紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。
       1.2 试剂 工业乙醇(甘肃黄羊镇糖厂生产);其余试剂为分析纯;儿茶素对照品(批号：877-200001，中国药品生物制品检定所);芦丁对照品(批号：100080-200306，中国药品生物制品检定所提供);DPPH 对照品(批号：S43654-098，美国 Sigma 公司)。
       1.3 材料锁阳购自甘肃省兰州市黄河药市，样品由中科院兰州化物所戚欢阳副研究员鉴定为锁阳科植物锁阳Cynomorium songaricum Rupr.，粉碎成黄豆大颗粒，备用。
       2 方法与结果
       2.1 提取溶剂的选择分别用60%，95% 的乙醇溶液和水做提取溶剂进行预实验，以儿茶素提取率为评价指标。结果表明，在相同条件下，儿茶素提取率按照原药材计算分别为：1.25，0.82，0.87 mg·g-1，故选择60% 的乙醇做为提取溶剂。
       2.2 样品测定
       2.2.1 浸膏得率测定按“2.3”项制备样品，精密吸取样品液20 ml，置105℃已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥5 h，置干燥器中冷却1 h，迅速称重，按下式计算浸膏得率。结果见表1。
       浸膏得率(%)=W×10020×M×100%(W为浸膏质量，M为样品质量)
       2.2.2 含量测定按“2.3”项制备样品，将样品溶液超声混匀，静置，取上清液，参照文献方法 [8]进行儿茶素含量测定。精密吸取1 ml上清液置入50 ml容量瓶中，用60% 的乙醇定容至刻度，超声混匀，放置30 min，参照文献方法 [8，9]进行总黄酮含量测定。取上清液用60% 的乙醇稀释，参照文献 [10，11]建立的DPPH法进行抗自由基活性实验。
       2.3 正交实验设计及结果精密称定约20 g的锁阳细粉，于500 ml的圆底烧瓶中，按表1正交实验进行提取。过滤提取液，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至近干，用60% 的乙醇转移至100 ml容量瓶中，定容、备用。按照“2.2”项样品测定分别测定浸膏得率、总黄酮含量、儿茶素含量和抗自由基活性。结果见表1。表1 正交实验及结果
       2.4 方差分析以综合指标为评价指标，由表1中极差R值大小显示，各因素作用主次为A> B >C;由表2方差分析结果表明，A因素的影响具有显著性意义，B因素和C因素无显著性意义，以A3B3C1为佳。表2 方差分析
       3 讨论
       3.1 综合指标的确定与最佳条件的选择传统中药提取工艺的研究一般都以提取一类或几类化合物为目的，选择浸膏得率和化学成分提取率为指标，没有结合其药理活性，可能造成不可靠的实验结论。故本实验结合化学指标(浸膏中的总黄酮含量、儿茶素含量)和生物学指标(抗自由基活性)确定综合指标，得出更结合实际的提取工艺条件。工艺生产中，以得到高含量的黄酮和高产量的浸膏为目的，故将锁阳提取物浸膏中总黄酮的质量分数权重设定为0.6。儿茶素不仅是锁阳中主要的黄酮类化合物，而且是锁阳中具有明确药理活性的有效成分，所以将其权重设定为0.2。锁阳黄酮有明确的清除自由基活性[7]，研究提取工艺的实际意义是使有明确药理成分的物质含量达到最佳，故将抗自由基活性的权重设定为0.2。以综合指标为评价指标，最终筛选的最佳工艺条件为： A3B3C1。即60 % 的乙醇为提取溶剂，物料比为1∶14， 提取时间为3.0 h， 共提取1 次。
       3.2 总黄酮含量测定结果的误差应用UV法测定锁阳总黄酮，由于受方法学所限，锁阳提取物中其它成分的干扰以及方法稳定性等问题，致使误差较大, 结果高于实际含量[12]，但是这种误差对正交实验结果的比较并不会造成很大影响。
       3.3 锁阳黄酮提取物的清除自由基实验锁阳中黄酮类成分具有比较明显的抗自由基活性。但由于提取物成分的复杂性，锁阳提取物的清除自由基活性也可能是黄酮类成分和其它成分协同作用的结果。还应该进一步通过锁阳中黄酮类化合物单体的药理实验论证其生物活性，然后结合锁阳黄酮类化合物的含量进一步优化锁阳中总黄酮的最佳提取工艺。
       【参考文献】
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