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       【摘要】 
       目的探讨离体培养中诱导材料对盾叶薯蓣再生植株中薯蓣皂苷元含量的影响。方法采用高效液相色谱(HPLC)法对不同材料诱导的再生植株中薯蓣皂苷元含量进行分析。结果薯蓣皂苷元含量高的材料诱导的再生植株中薯蓣皂苷元含量一般也较高;相同材料诱导的再生植株中薯蓣皂苷元含量差异不明显。结论盾叶薯蓣具有一定的遗传稳定性，要获得薯蓣皂苷元含量不低于2%的皂苷工业原料，选择薯蓣皂苷元含量高的种质引种和培育优良品种是十分重要的。
       【关键词】  盾叶薯蓣; 再生植株; 高效液相色谱; 薯蓣皂苷元
       种质资源是药材生产的源头。种质的优劣对药材的产量和质量有决定性的影响。种质资源在药材优良品质形成过程中起着关键性作用，是培育优良品种的遗传物质基础，尤其是野生亲缘植物和古老的地方种是长期自然选择和人工选择的产物，具有独特的优良性状和抗御自然灾害的特性，是人类的宝贵财富和品种改良的源泉。盾叶薯蓣是一个分布较广的物种，但由于地方品种和地域的双重影响，薯蓣皂苷元含量差别很大，质量难以控制;本实验用薯蓣皂苷元含量不同的盾叶薯蓣作为离体培养中诱导再生植株的材料，分别测定其再生植株中薯蓣皂苷元含量，研究在离体培养中盾叶薯蓣的遗传稳定性，为盾叶薯蓣GAP的制定及优良种质的选择和培育提供依据。
       1 仪器与试药
       1.1 材料采集不同产地的盾叶薯蓣(见表1)，样品由秦慧贞和丁志遵研究员鉴定为盾叶薯蓣。将其移植于中国科学院江苏省植物所苗圃内，春季萌发后，采取地上部分幼嫩茎叶，诱导愈伤组织，并分化成完整植株[1](愈伤组织培养基：MS+BA2.0 mg·L-1 +2，4-D0.1 mg·L-1;分化培养基：MS+BA0.1 mg·L-1 +病毒唑5.0 mg·L-1;生根培养基：MS/2+IAA0.2 mg·L-1 +NAA0.2 mg·L-1)。春季将植株移栽于苗床上，生长不同时间后采收地下根茎。去除泥沙，切片、在60℃干燥至恒重，粉碎过60目筛，备用。表1 样品情况%
       1.2 仪器及试剂索氏提取器;旋转蒸发器;Agilent 1100 Series;Econobase C18 (5 μm, 4.6 mm×150 mm ) 超声仪;微孔过滤器;硫酸;石油醚;薯蓣皂苷元对照品;无水乙醇;甲醇(色谱醇)等。
       2 方法与结果
       2.1 薯蓣皂苷元提取条件及测定方法研究提取方法采正交实验，因素及水平见表2。表2 因素水平
       2.1.1 薯蓣皂苷元粗提取物的提取[2～4]精密称取盾叶薯蓣粉末10g，置于三角瓶中，采用不同方法对其进行预处理后加入不同浓度、不同量的硫酸，在100℃水浴锅中水解4 h，放冷过滤，药渣用蒸馏水洗至中性，60℃干燥后，用石油醚(60～90℃)50 ml在90℃水浴中索氏提取不同时间，提取液回收至一定体积，转入已知重量的蒸发皿中，60℃下烘干得皂苷元粗提取物。
       2.1.2 薯蓣皂苷元测定方法考察
       供试品溶液制备：用无水乙醇将薯蓣皂苷元粗提取物溶解，过滤至一定体积的容量瓶中，用无水乙醇定容待测定。
       对照品溶液制备：准确称取薯蓣皂苷元标样0.002 g，置2 ml容量瓶中，用无水乙醇溶解，稀释至刻度，得1 μg·μl-1的标准溶液备用。
       色谱条件选择：通过参考文献[5～6]并经反复实验确定分析条件为：Econobase C18 (5 μm, 4.6 mm×150 mm )。无水甲醇为流动相，进样量5 μl，流速0.5 ml·min-1, 检测波长203 nm, 柱温为室温。样品中薯蓣皂苷元与其它成分达到良好分离(见图1)。
       线性关系考察：精密吸取对照品溶液1，2，4，6，8，10 μl，按“2.1.2”中确定的色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，进样量为横坐标进行回归处理，得回归方程为Y=-3.524 1+64.87X，r=0.997 8。
       图1 薯蓣皂苷元HPLC图
       精密度实验：精密吸取对照品溶液5 μl, 重复进样5次，其RSD为1.5%。
       重复性实验：取盾叶薯蓣样品粉按上述方法进行供试样品液的制备、测定，重复5次，结果薯蓣皂苷元平均含量为1.86%，RSD为0.98%。
       稳定性实验：薯蓣皂苷元化学结构较稳定，将待测供试品溶液室温下放置7 d，再测定，结果色谱图上未出现异常峰，薯蓣皂苷元含量较稳定。
       回收率实验：采用加样回收法，取已测定含量的盾叶薯蓣样品一定量，分别添加不同量的薯蓣皂苷元对照品，按上述方法进行供试品溶液的制备、测定，结果薯蓣皂苷元的平均回收率为105.2%，RSD为4.2%(n=5)。
       2.1.3 提取结果分析提取实验结果见表3。结果表明，提取薯蓣皂苷元所用硫酸的浓度以2.0 mol·L-1为最佳，回流时间为5h或6h。水解前对材料进行超声处理可以提高薯蓣皂苷元提取率;水解所用酸的浓度对薯蓣皂苷元的提取率影响最大;在Econobase C18 (5 μm, 4.6 mm×150 mm )，无水甲醇为流动相，进样量5 μl，流速0.5 ml·min-1, 检测波长203 nm分析条件下，样品中薯蓣皂苷元与其它成分达到良好分离。表3 不同提取方法薯蓣皂苷元含量
       2.2 不同再生植株薯蓣皂苷元含量分析
       2.2.1 供试品溶液制备精确称取盾叶薯蓣粉末0.5～0.6 g，置于三角瓶中，加2.0 mol·L-1的硫酸50 ml，超声处理20 min后在100℃水浴锅中水解4h，放冷过滤，药渣用蒸馏水洗至中性，60℃干燥后，用石油醚(60～90℃)50 ml在90℃水浴中索氏提取5 h，提取液回收至干后用无水乙醇溶解，过滤置10 ml的容量瓶中，用无水乙醇定容待测定。
       2.2.2 对照品溶液制备精确称取薯蓣皂苷元标样0.002 g，置2 ml容量瓶中，用无水乙醇溶解，稀释至刻度，得1 μg·μl-1的标准溶液备用。
       2.2.3 相同材料诱导的再生植株薯蓣皂苷元含量以J12材料的叶片为外植体，诱导盾叶薯蓣再生植株，根据外观性状差异建立两个株系J12Z2和 J12Z9，在田间生长不同时间后，按照上述色谱条件对薯蓣皂苷元含量进行测定(见表4)。结果表明，再生植株虽然在外观性状上发生了变化，但在田间生长不同时间后，薯蓣皂苷元含量差异不明显。说明诱导阶段，控制薯蓣皂苷元合成的基因可能没有发生变异。另外，随着生长时间的延长，皂苷元含量呈上升趋势，田间生长3年的再生植株中薯蓣皂苷元含量已接近于种根含量水平。表4 相同材料诱导的再生植株薯蓣皂苷元含量
       2.2.4 不同材料诱导的再生植株薯蓣皂苷元含量分析分别以W67， W77， B84，J12材料的叶片为外植体，诱导盾叶薯蓣再生植株，在田间生长不同时间后，按照上述色谱条件对薯蓣皂苷元含量进行测定(见表5)。结果表明不同来源材料诱导的再生植株在田间生长相同时间后，薯蓣皂苷元含量差异很大。种根中薯蓣皂苷元含量高的材料诱导的的再生植株在田间生长相同时间后皂苷元含量一般也较高，生长1年后就明显地表现出来。但是薯蓣皂苷元含量较高的材料诱导的再生植株在田间生长3年后，皂苷元含量有时难以达到原材料的含量水平，仅为原材料皂苷元含量的50%～60%，而薯蓣皂苷元含量较低的原种诱导的再生植株在田间生长3年后，皂苷元含量基本与原种相同，仍然保持在较低的水平。表5 不同材料诱导的再生植株薯蓣皂苷元含量
       3 讨论
       实验结果说明，盾叶薯蓣具有一定的遗传稳定性，因此要获得薯蓣皂苷元含量不低于2%的皂苷工业原料，选择薯蓣皂苷元含量高的种质作为引种和繁殖材料仍然是重要的。
       要保证薯蓣皂苷元含量符合工业要求，在保证优良种质的前提下，还要求有适合盾叶薯蓣生长的生态环境及配套的栽培管理措施，由本研究结果可知，无论何种种源，要获得薯蓣皂苷元含量不低于2%的盾叶薯蓣，要保证其生长3年才能采收。但据调查，目前种植盾叶薯蓣的药农基本都是在盾叶薯蓣生长1～2年后采收，这是造成市场上收购的盾叶薯蓣质量不合要求的一个重要原因，也是导致盾叶薯蓣出现“过剩”现象的原因。
       【参考文献】
         　[1] 谢彩侠，高山林，秦慧贞， 等.盾叶薯蓣同源四倍体的诱导和鉴定[J].药物生物技术，2005，12(1)：15.
       
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