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       【摘要】 
       目的研究杜仲水提物对CCl4所致小鼠肝损伤的保护作用。方法采用0.08%CCl4造成小鼠急性肝损伤，检测ALT，AST，SOD的活性和MDA，GSH-Px的水平。将肝大叶HE染色，观察杜仲水提物对小鼠肝脏组织病理学的影响。结果杜仲水提物能明显降低CCl4所致的肝损伤小鼠肝脾指数的升高(P<0.01)和血清中ALT、AST活性的升高(P<0.01);亦能降低肝组织中MDA 的水平，增加肝组织中SOD的活性和GSH-Px的水平(P<0.01)。结论杜仲水提物具有显著的抗肝损伤的作用。
       【关键词】  杜仲; 四氯化碳; 肝损伤
       Protective Effect of the Water Extract from Eucommia ulmoides Oliver against Liver Injury in Mice
       ZHOU Chengyan1,YU Haiping2,TAO Zhibin1,GAO Yanshan1，BIAN Hongrong1
       (1.North China Coal Medical College,Tangshan 063000,China;2.Tangshan Traditional Chinese Medicine Hospital,Tangshan 063000,China)
       Abstract：ObjectiveTo study the protective effect of the water extract from Eucommia ulmoides against liver injury in mice induced by Carbon Tetrachlitied(CCl4).MethodsMouse model with liver injury was induced by 0.08% CCl4.Activities of ALT,AST,SOD were examined ,and levels of MDA,GSH were determined.ResultsThe water extract from Eucommia ulmoides could remarkably resist the increase of ALT,AST(P<0.01),decrease MDA level(P<0.01),and improve SOD activtity and GSH-PX level(P<0.01).ConclusionThe water extract from Eucommia ulmoides has remarkable protective effect against liver injury in mice..
       Key words：Eucommia ulmoides Oliver; Carbon tetrachlotide(CCl4); Liver-injury
       杜仲Eucommia ulmoides Oliver又名丝连皮、扯丝皮等，杜仲科杜仲属落叶乔木，为我国特有树种。《神农本草经》、《本草纲目》均把杜仲列为中上品，并明确记载了其功效：“主治腰脊疼，补中，益精气，坚筋骨，强志，除阴下痒湿，小便余沥，安胎，久服轻身不老”[1] 。本文实验研究杜仲水提物对CCl4造成的肝损伤小鼠的影响，并初步探讨其作用机制，为杜仲的进一步开发利用提供实验依据。此实验尚属首次。
       1 材料与仪器
       1.1 药品谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)试剂盒(批号 20080327);超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(批号 20080414);以上试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。联苯双酯，为浙江医药股份有限公司新昌制药厂产品，批号 070806;四氯化碳(CCl4，分析纯)，为天津市药通化学试剂有限公司，批号 20060215;实验时用花生油配成0.08% CCl4溶液。试剂标准样品： Pb，As，Hg，Cd，Al标准液，均为1 mg/ml(中国计量科学院计量所，批号20080102)。
       1.2 动物清洁级昆明种鼠，雌雄各半，体重18～22 g。由河南省实验动物中心提供，合格证号：SCXK豫2005～0001。
       1.3 仪器Biofuge strutos型高速低温离心机(Kendro Laboratory products)。JY92-2D型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)。YKH-I型液体快速混合器(江西医疗器械厂)。TU-1800紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。DK-8D数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)。仪器美国PE一5000原子吸收分光光度计， Pb，As，Hg，Cd，Al空心阴极灯。
       2 方法[2]
       2.1 杜仲皮的采制和质量标准鉴定杜仲，于河北省唐山市郊区2008-03-25自行采制剥取，树龄为20年，刮去粗皮，堆置“发汗”至内皮呈紫褐色，晒干，存放在通风良好的阴面标本室备用。经华北煤炭医学院药剂学教研室韩刚鉴定为杜仲科植物杜仲Prismatomeris tetrandra (Rox -b.) K. Schum. 的树皮。因此次采集的植物为自然野生生长，没用过任何农药，因此无任何农药残留。笔者参照2005版本《中国药典》记载的高效液相色谱法对其有效成分进行了测定，本品含松脂醇二葡萄糖苷(C32H42O16)为0.25%，完全符合药典要求。并对其进行了5种重金属元素的含量测定，含As 0.007 57μg·g-1，含Pb0.044 6μg·g-1，含Hg 0.007μg·g-1，含Cd 0.013 0μg·g-1，含Al0.005 464μg·g-1，亦完全符合《中国药典》要求。因此得出结论，本次采集的杜仲，完全符合《中国药典》要求，可以入药使用。
       2.2 杜仲水提物的制备及其质量控制标准将杜仲皮粉碎成粗粉，用水加热提取两次，合并提取液，滤过，浓缩至所需浓度，于4℃冰箱保存备用。通过计算，所提取物占生药的比率为6.67%。
       杜仲水提物成分群主要为各种多糖和黄酮类。笔者参照2005版本《中国药典》记载的高效液相色谱法，对水提物中的标志性成分松脂醇二葡萄糖苷进行了测定，结果含松脂醇二葡萄糖苷(C32H42O16)为3.58%。
       2.3 杜仲水提物对CCl4致小鼠肝损伤的影响小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，每组10只，即正常组，模型组，阳性组，中药高剂量组、中剂量组、低剂量组。各组每天ig，给药容量为20 ml·kg-1·d-1，连续10 d。正常组和模型组给予蒸馏水，阳性组给予联苯双酯0.60 g/kg，中药高、中、低剂量组分别给予杜仲水提液163.80，81.90，40.95 g生药/kg。末次给药后禁食不禁水，8 h后，除正常组外，其余各组均腹腔注射(ip)0.08%CCl4花生油溶液0.1 ml/10g，12 h后眼球取血，分离血清。
       2.4 检测指标检测血清中的ALT，AST的活性;取肝脏、脾脏称量，计算肝指数、脾指数;取一部分肝脏用生理盐水制成10%的肝匀浆，用于检测肝组织中的SOD的活性、MDA和GSH-Px的水平。将肝大叶用10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，然后评分。
       2.5 数据处理各组实验数据均以 ±s表示，采用统计软件SPSS13.0进行组间t检验，P<0.05有统计学意义。
       3 结果
       3.1 杜仲水提物对小鼠肝脏、脾脏系数的影响结果见表1。与正常组比较，模型组小鼠肝脾重量明显增加，肝脾指数显著升高(P<0.01)。与模型组比较，杜仲水提物各剂量组小鼠肝脾指数显著降低(P<0.01)，并呈现剂量依赖性。结果提示，杜仲水提物能明显对抗CCl4致肝损伤小鼠肝脾指数的升高。表1 杜仲水提物对CCl4致肝损伤小鼠的肝脾重量及肝脾指数的影响与正常对照组比较，**P<0.01;与模型对照组比较，▲▲P<0.01;与中药高剂量组比较，●●P<0.01;与中药中剂量组比较，##P<0.01;n=10
       3.2 杜仲水提物对小鼠血清中ALT，AST的影响结果见表2。常规分离血清，按照说明书的要求测试ALT，AST的活性。与正常组比较，模型组小鼠血清中ALT，AST活性显著升高(P<0.01)，提示造模成功。与模型组比较，杜仲水提物各剂量组大鼠血清中ALT、AST活性的显著降低(P<0.01)，并呈现剂量依赖性。结果提示杜仲水提物能显著对抗CCl4导致的肝损伤小鼠血清中ALT，AST的活性升高。表2 杜仲水提物对CCl4致小鼠肝损伤血清中ALT，AST活性的影响
       3.3 杜仲水提物对小鼠肝组织中SOD活性，MDA、GSH-Px水平的影响结果见表3。与正常组比较，模型组小鼠肝组织中SOD活性、GSH-Px水平显著降低(P<0.01)，MDA水平显著增加(P<0.01)，提示造模成功。与模型组比较，杜仲水提物各剂量组小鼠肝组织中MDA的含量显著降低(P<0.01)， 而肝组织中的SOD的活力和GSH-Px的水平显著增强(P<0.01);并且杜仲水提物各剂量组效果呈现剂量依赖性。结果提示,杜仲水提物能显著的对抗CCl4导致的肝损伤小鼠肝组织中MDA的升高，同时能显著对抗肝组织中SOD的活力和GSH-Px的水平的降低。
       3.4 杜仲水提物对小鼠肝脏组织病理学的影响见图1。肝组织病理检查结果表明，正常对照组：小鼠肝小叶结构清楚，肝细胞正常，未见明显病理改变。模型对照组：小鼠肝细胞有较多点状坏死，肝细胞体积明显增大，广泛水肿，部分肝细胞脂肪变性;肝血窦受压，变窄;间质及汇管区有不等量的炎性细胞浸润;与正常组比较有显著性差异，提示造模成功。阳性对照组：小鼠肝细胞水肿不明显，偶见点状坏死，汇管区少量炎细胞浸润。杜仲水提物各剂量组：各给药组小鼠肝细胞病变明显好转，其中高剂量组效果最好，小鼠肝细胞水肿不明显，可见肝细胞再生现象，偶伴有点状坏死，汇管区少量炎细胞浸润;与高剂量组相比中剂量组效果稍差;低剂量组效果最差，但是小鼠肝细胞水肿亦明显减轻，部分肝细胞恢复正常。表3 杜仲水提物对CCl4致肝损伤小鼠肝组织中SOD活性的影响和肝组织中MDA，GSH-Px水平的影响
       4 讨论
       CCl4 急性肝损伤模型是最早使用的一种经典的实验性肝损伤动物模型，应用最多最广、最成熟，同时此模型还能准确反映肝细胞的功能、代谢及形态学变化,重复性较好[3]，因此一直是筛选具有保肝降酶作用药物的常用模型之一[4]，与病毒性肝炎的病理解剖、病理生理诸方面的改变和表现出来的症状及肝功能检测的指标等方面具有相似性[5]。一般认为CCl4损伤肝组织机制是CCl4经肝细胞色素P450代谢激活后生成三氯甲基自由基(·CCl3)和氯自由基(·Cl)，引起生物膜脂质过氧化，造成膜结构和功能损伤，蛋白质等物质合成代谢发生障碍，导致肝细胞损伤坏死，胞浆内转氨酶渗入血液，肝细胞脂质过氧化或坏死。CCl4在体内对肝细胞亲和力大，自由基的形成及引发的链式反应是CCl4损伤肝组织的主要机制[6]。诱导微粒体细胞色素P450同工酶活性的物质可增加CCl4产物的肝毒性,因此在制模过程中加入戊巴比妥或乙醇代替饮水是加速肝损伤进程的常用方法[7]。
       根据肝损伤的病因病机，中医对其进行辨证论治须采用清热解毒、利胆除湿、健脾和胃、理气活血、软坚散结、养血柔肝、滋补肝肾等方法。杜仲具有补中、益精气、坚筋骨的功效，在前期的实验研究和调查中就已显示其具有较好的抗肝损伤的作用[1]。本实验结果亦显示，杜仲水提物能明显降低CCl4所致的肝损伤小鼠肝脾指数的升高(P<0.01)和血清中ALT、AST活性的升高(P<0.01);亦能降低肝组织中MDA 的水平，升高肝组织中SOD的活性和GSH-Px的水平(P<0.01)。因此杜仲具有明显的抗肝损伤的作用，杜仲高剂量组的效果最好，中剂量组次之，低剂量组最差，3个剂量组呈现良好的剂量关系。推测其抗肝损伤的机理可能与能增强小鼠清除自由基的能力，能抑制自由基启动的脂质过氧化反应，肝细胞受到自由基攻击时可因其过度消耗而减少有关。但是，杜仲抗肝损伤的作用还没有深入研究，因此本实验对其进行的系统研究，将对开发杜仲成为新的抗肝损伤的药物具有极大的参考价值。
       【参考文献】
         　[1] 江苏新医学院.中药大辞典(上册)[M].上海：上海科学技术出版社，1986：2090.
       
       [2] 徐叔云，卞如濂，陈 修，等. 药理实验方法学，第3版[M].北京：人民卫生出版社， 2002：1346.
       
       [3] 于 强,于 洋. 肝损伤动物模型及中药治疗研究概况[J]. 中国现代中药, 2006, 8(11): 25.
       
       [4] Bozkurt S, Ersoy E, Tekyn HE. The eytoprotective effort of iloprost against carbon tetrachloride induced hecrosis in rat liver[J]. Res common Mol Pathol pharmacol, 1997, 95(3): 343.
       
       [5] 龚峻梅，朴英杰，陈素云，等. 山荷降脂方对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用[J]. 暨南大学学报(医学版)，2000，22(6)：71.
       
       [6] Shah H, Hartman S P, Weinhouse S. Formation of carbonyl chioride in carbon tetrachloride metabolism by rat liver in vitor [J]. Cancer Res , 1979, 39: 3942.
       
       [7] 李艳辉. 实验性肝损伤模型的建立和评价[J].放射学实践，2006，21(10)：1075.