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       【摘要】 
       目的筛选假奓包叶抗菌活性部位的最佳分离工艺。方法以没食子酸为检测指标，采用HPLC测定没食子酸的含量，对假奓包叶的提取分离工艺进行研究。结果最佳工艺为：以水作为溶剂，采用温浸法提取，原料粉碎为中粉，液料比20∶1(g∶ml)，提取温度为50℃，提取时间8 h,提取1次。结论该提取分离方法提高了假奓包叶的利用率，且简便可行，提取物具有抗菌活性，可用于工业生产。
       【关键词】  抗菌活性部位; 假奓包叶; 提取工艺
       假奓包叶又名金沙叶、艾桐、老虎麻，原植物为大戟科假奓包叶属植物假奓包叶Discocleidion rufescens (Franch.) Pax et Hoffm.，主产于陕西、甘肃、湖北、湖南、川贵等地[1]。民间以根皮入药，具有清热解毒、泄水消积的功效，用于治疗水肿、食积、毒疮、鹅掌风等症[2]。在对其化学成分研究中发现，该植物中含有的结构类型包括黄酮类、有机酸类、三萜类和蒽醌类化合物等，其中，没食子酸的含量较高，且该化合物具有抗菌、杀锥虫、抗肿瘤、清除自由基和抗氧化等药理活性[3～6]。故本研究以没食子酸含量作为指标，对假奓包叶叶中的抗菌活性成分的提取工艺进行初步研究和探讨。
       1 仪器与试药
       LC-2010A型高效液相色谱仪(日本岛津公司);AE240S型电子分析天平(瑞士METTLER公司);HS6150D超声振荡仪(天津市恒奥科技发展有限责任公司);RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HH-4型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);SHZ-D循环水真空泵(河南巩义市英峪予华仪器厂)。
       假奓包叶采于陕西汉中地区，经西安交通大学医学院药学系天然药物化学研究室王军宪教授鉴定为大戟科植物假奓包叶Discocleidion rufescens (Franch.) Pax et Hoffm.的叶;没食子酸对照品(实验室自制，纯度>98%);高效液相用甲醇为色谱纯;蒸馏水自制;其余试剂均为分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 含量测定
       2.1.1 色谱条件色谱柱为Dikma Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液(5∶95)，检测波长为269 nm;流速为1.0 ml·min-1;柱温为25℃。
       2.1.2 对照品储备液的制备 精密称取没食子酸对照品21.8 mg，置于50ml的容量瓶中，用甲醇配成浓度为0.436 mg·ml-1的对照品储备液，备用。
       2.1.3 供试品溶液制备取干燥假奓包叶叶粗粉1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水20 ml，50℃下温浸提取8 h，放冷，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 ml至蒸发皿中，蒸干，残渣用甲醇转移并定容至5 ml容量瓶内，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
       2.1.4 标准曲线及线性关系考察 精密吸取对照品储备液0.10，0.80，1.60，2.50，3.75，5.00ml，分别置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，分别精密吸取上述溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以没食子酸对照品浓度(mg·ml-1)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=3 × 107X + 508 65(r =0.999 6)，表明没食子酸的浓度在0.004～0.218 0 mg·ml-1与峰面积呈良好的线性关系。
       2.1.5 精密度实验 精密吸取上述“2.1.4”项浓度为0.109 0 mg·ml-1的对照品溶液，重复进样5次，10 μl/次，平均峰面积为386 573，RSD为0.44%，说明仪器精密度良好。
       2.1.6 重复性实验 取同批号的假奓包叶叶样品5份，依法制备供试品溶液，按拟定的色谱条件进行测定，并按外标法计算，结果测定没食子酸的平均含量为0.427%，RSD为2.17%。
       2.1.7 稳定性实验 取没食子酸对照品溶液，分别在0，2，4，6，8，12，24 h进样1次，依法测定，平均峰面积为3 105 072，RSD为0.60%，说明没食子酸稳定性较好。
       2.1.8 加样回收率实验 精密称取假奓包叶叶粗粉1 g(相当于没食子酸约0.2 mg)，准确加入0.2 mg没食子酸对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品5份，分别进样10μl，测定峰面积，计算加样回收率。结果平均回收率为100.6%，RSD为1.68% 。
       2.2 提取工艺首先对提取溶剂和提取方法进行了筛选，并在此基础上采用正交法对提取工艺进行优选。选取5个对提取率影响较大的因素(粉碎度、液料比、温度、时间和次数)、每个因素选择3个水平进行考察，按L18(37)表安排实验，以没食子酸的含量为实验指标，筛选抗菌部位的最佳提取工艺。
       2.2.1 提取溶剂的选择取1 g假奓包叶粗粉3份，精密称定，分别置100 ml圆底烧瓶中，各加入蒸馏水、95%乙醇、70%酸性乙醇(用盐酸调pH值为2) 30 ml，置水浴锅中回流提取2 h，提取1次。提取完毕，过滤，精密吸取续滤液5 ml置蒸发皿中，在80℃水浴中蒸干，用甲醇溶解残余物，转移并定容至5 ml容量瓶中，经微孔滤膜过滤后，按“2.1”项下含量测定方法测定其含量，并按以下公式计算没食子酸的产率。
       没食子酸的产率(%)= 没食子酸含量(mg·ml-1)×体积(ml)药材重量(mg)× 100%
       2.2.2 提取方法的选择取1g假奓包叶粗粉3份，精密称定，置100 ml圆底烧瓶中，依次加入蒸馏水30 ml，分别采用冷浸法(常温)、温浸法(40℃)、煎煮法提取，提取时间均为2 h，提取1次。提取完毕，过滤，精密吸取各续滤液5 ml置蒸发皿中，在80℃水浴中蒸干，用甲醇溶解残余物，转移并定容至5 ml容量瓶中，经微孔滤膜过滤后，按“2.1”项下含量测定方法测定其含量，并按“2.2.1”项下公式计算没食子酸的产率(%)。
       2.2.3 正交实验根据数次预试结果，采用温浸法(40～60℃)，以水作为溶剂提取假奓包叶叶中的抗菌活性部位。为了进一步优选最佳的提取工艺，采用正交实验L18(37)设计安排实验，以没食子酸的产率为指标，具体考察药材粉碎度、液料比(g∶ml)、温浸温度、时间及次数5个因素，每个因素选3个水平，具体因素水平见表1。　表1 正交实验因素水平　
       精密称取干燥的假奓包叶1 g，共18份，按正交实验设计表(见表2)温浸提取。提取液过滤，分别精密量取各次提取液5，10，15 ml至蒸发皿中，蒸干，残余物用甲醇转移并定容至5 ml容量瓶内。按“2.1”项下的含量测定方法测定样品溶液中没食子酸的浓度(mg·ml-1)，并按“2.2.1”项下公式计算没食子酸的产率(%)。具体实验安排、结果和方差分析见表2～3。表2 L18(37)正交实验安排及结果表3 正交实验方差分析
       从表2的实验结果分析可以看出，在实验考察范围内，各因素对没食子酸含量的影响程度大小次序为：D>E>C>A>B。提取时间对提取液中没食子酸产率影响最大，液料比对产率的影响最小。从表3的正交实验方差分析可以看出，在实验考察范围内，仅提取时间因素各水平间具有显著性差异。结合实际操作，最终确定以没食子酸为指标的抗菌部位提取的最佳工艺条件是A2B1C2D3E1，即以水作为溶剂，采用温浸法提取，原料粉碎度为中粉，液料比为20∶1，提取温度为50℃，提取时间8 h，提取1次。
       2.2.4 提取物抗菌作用验证采用扩散法对所得提取物的体外抗菌活性进行检测。以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作为供试菌，用打孔器将定量滤纸制成直径6 mm的圆形小纸片，经高压灭菌处理，37℃烘干后，备用。采用划线法将供试菌株密集接种于营养琼脂平板，取一张滤纸片蘸取样本，紧贴于已接种过供试菌的平板表面，做好标记。置4℃下作用12 h，于37℃，48 h培养后测定抑菌环直径。结果显示，该提取物的抑菌环直径均在8～10 mm之间，具有一定的体外抗菌活性。
       3 讨论
       有文献报道用酸醇提取药材中的多酚类物质[7]，故我们也将这种方法列入至提取溶剂的考察中。结果发现，酸水提取液中的没食子酸含量较低，表明没食子酸在酸性条件下不稳定，不宜在酸性条件下提取。实验同时也考察了碱性条件下没食子酸的稳定性，取浓度为0.126 7 mg·ml-1的没食子酸对照品甲醇溶液，用4%NaOH调pH为12，密塞后于60℃下静置0.5 h，测定静置前后没食子酸的含量，结果显示静置后无法测出没食子酸的色谱峰，说明没食子酸在碱性下不稳定，不宜在碱性条件下提取。
       在预试和正交实验的基础上，我们初步筛选出假奓包叶中抗菌活性部位的提取工艺，通过体外抗菌实验验证，证实其具有一定的抑菌活性。该方法简便可行，可用于工业生产。
       【参考文献】
         　　[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志，四十四卷，第3分册[M]. 北京：科学出版社，1979：64.
       
       [2] 中国药材公司.中国中药资源志要[M].北京：科学技术出版社，1994：625.
       
       [3] Nose M，Koide T，Morikawa K，et al. Formation of reactive oxygen intermediates might be involved in the trypanocidal activity of gallic acid[J]. Biol Pharm Bull，1998，21(6)：583.
       
       [4] Ohno T，Inoue M，Ogihara Y. Cytotoxic activity of gallic acid against liver metastasis of cells P815[J]. Anticancer-Res，2001，21(61A)：3875.
       
       [5] Qiu X，Takemura G，Koshiji M，et al. Gallic acid induces vascular smooth muscle cell death via hydroxyl radical production[J]. Heart Vessels，2000，15(2)：90.
       
       [6] Yoshino M，Haneda M，Naruse M，et al. Prooxidant action of gallic acid compounds：copper-dependent strand breaks and the formation of 8-hydroxy-2"-deoxyguanosine in DNA[J]. Toxicol In Vitro，2002，16(6)：705.
       
       [7] 张赟彬，缪存铅. 甘薯渣中多酚类物质的提取工艺研究[J]. 粮油加工，2007，9：115.