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       【摘要】 
       目的研究中药熏蒸疗法对II型胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠血清中炎性细胞因子IL-1β和IL-lra水平及IL-lra/IL-1β比值的影响。方法建立II型胶原诱导的大鼠模型,ELISA法检测大鼠血清中IL-1β和IL-ra的含量，计算IL-ra/IL-1β比值。结果中药熏蒸能明显降低CIA血清中IL-β含量及升高ILra及IL-ra/IL-1β比值。结论中药熏蒸疗法具有抑制CIA大鼠关节炎症的作用,其机制可能与调节体内炎性细胞因子IL-1β及抗炎性细胞因子IL-ra的水平有关。
       【关键词】  中药熏蒸疗法; CIA; IL-1β; IL-ra; IL-ra/IL-1β; 抗炎机理
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of the Chinese herb fumigation and steaming therapy on the contents of IL-1β、IL-ra and IL-ra/IL-1βin serum of rats with collagen-induced arthritis(CIA).MethodsTo establish the CIA model ,and measure the contents of IL-1β, IL-ra in serum ，calculate the ratio of IL-ra/IL-1β. ResultsThe Chinese herb fumigation and steaming therapy could lower the levels of IL-β and elevate the level of IL-ra and IL-ra/IL-1β significantly in serum of rats with CIA.ConclusionThe Chinese herb fumigation and steaming therapy has the effects of anti-inflammation on rats with CIA， and its mechanism may be related to regulating the levels of IL-1β and IL-lra .
       Key words：The Chinese herb fumigation and steaming therapy; CIA; IL-1β; IL-ra; IL-ra/IL-1β; Anti-inflammatory mechanism
       类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜慢性炎症病变为主要特征的自身免疫性疾病。其主要病变发生在滑膜,累及关节软骨、韧带、肌腱及全身组织,引起关节肿痛,继而软骨破坏,关节间隙变窄，晚期关节畸形,功能活动障碍,最终导致不同程度的残疾。我们临床上使用中药熏蒸疗法治疗类风湿性关节炎疗效显著，而且曾运用中药熏蒸疗法治疗AA模型大鼠，观察相关指标，以证明此疗法的疗效及治疗机制[1，2]。本实验中复制目前RA最理想的模型，即CIA模型，用中药熏蒸疗法对其进行干预，并检测其对CIA模型大鼠血清中IL-1β、IL-ra含量及IL-ra/IL-1β比值的影响,进一步探讨其治疗RA可能的机制。
       1 材料与仪器
       1.1 动物健康清洁级雄性Wistar大鼠40只，体质量(80±20)g，广州军区广州总医院实验动物中心提供。
       1.2 药物熏蒸1号方(含羌活20 g,独活20 g,防风15 g，桂枝15 g，细辛10 g，川芎20 g，海风藤30 g，徐长卿30 g，姜黄20 g，苏木20 g，冰片1 g)，由广州军区广州总医院中药房提供。熏蒸方中前10味中药由自动煎药机煎煮成53.3%浓度的中药液保存，熏蒸治疗时按高低浓度分别稀释成6.67%和3.33%浓度的中药液，冰片待熏蒸治疗前加入中药液中。
       1.3 中药熏蒸治疗设备自制动物熏蒸装置;电子恒温三用水箱，广东省汕头市医用设备厂产品，型号HH·W21·Cr42II;T型管足肿测量仪(自制)。
       1.4 试剂小牛源II型胶原，广州威佳生物科技有限公司提供，Chondrex公司产品;弗氏不完全佐剂，广州威佳生物科技有限公司提供，Calbiochem公司产品;大鼠IL-1β、IL-lra的ELISA检测试剂盒。
       2 方法
       2.1 CIA大鼠模型复制和分组治疗 将40只大鼠随机留取8只作为正常组，其余32只待造模，适应性喂养3 d。取10 mg小牛源II型胶原溶于配制好的0.1 mol/L乙酸5 ml，然后放置4℃冰箱内过夜，次日按2 mg/ml比例与弗氏不完全佐剂1∶1混合，用注射器反复抽吸,直至混合物完全、充分乳化，以乳化物滴入水中不松散为度(在冰浴中操作);取乳化后大鼠CIA造模剂，于大鼠尾根部及左足底皮内按0.5 ml/只注射,并轻微压迫注射部位30 s，以使乳化物吸收完全。注射后第1天，部分造模组大鼠注射区局部皮肤发红、轻度肿胀、皮温升高，活动欠灵活;第2日部分造模大鼠左后足肿胀继续加重，并于3～7 d开始逐渐消退;至第8日按以上同样的方法再次注射0.3 ml/只，注意需避开上次注射部位;第14天大部分造模大鼠左后足和部分右后足关节出现肿胀、皮肤发亮、充血及关节活动受限;第21天大部分双后足关节及部分前足关节肿胀达到高峰，部分大鼠出现皮肤溃疡。多发性关节炎的出现表明大鼠CIA模型建立成功。造模后第21天，32只模型大鼠随机分成4组，模型组、水熏组、低熏组、高熏组各8只。正常组和模型组常规喂养，不做熏蒸处理;水熏组给予(57±1)℃蒸馏水熏蒸，蒸气温度为(39±1)℃;低熏组给予相同温度3.33%的中药液熏蒸;高熏组给予相同温度6.67%的中药液熏蒸。将大鼠放入自制动物熏蒸装置，开启电子恒温水槽，待蒸气温度达到熏蒸要求时，开始熏蒸并计时，熏蒸20 min/次，连续20 d。
       2.2 大鼠血清的获取及IL-1β、IL-1ra含量的测定造模后第41天，以自配麻醉剂(5%盐酸氯胺酮注射液20 ml，2.5%盐酸异丙嗪注射液20 ml，0.05%硫酸阿托品注射液10 ml混匀)，于每只大鼠腹腔注射0.6～0.8 ml，迅速麻醉，麻醉后心腔取血，采用ELISA法测定IL-1β，IL-1ra，并计算IL-ra/IL-1β比值，以上操作需严格按检验试剂盒说明书步骤执行。
       2.3 统计学处理采用SPSS11.5统计软件，运用单因素方差分析进行多组间两两比较，统计结果以±s形式表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。
       3 结果
       3.1 中药熏蒸疗法对CIA大鼠血清IL-1β含量影响表1显示，各造模组的IL-1β含量均显著升高，与正常组比较有非常显著差异(P<0.01);经中药熏蒸治疗后，各熏蒸组IL-1β含量的下降与模型组比较，均有显著差异(P<0.05～0.01);高熏组在IL-1β含量下降方面与水熏组比较有显著差异(P<0.05)，但低熏组与水熏组比较无差异;低熏组与水熏组比较，前者对此指标的改善好于后者，但统计上未见明显差异。
       3.2 中药熏蒸疗法对CIA大鼠血清IL-1ra含量影响表1显示，各造模组的IL-1ra含量均显著降低，与正常组比较有非常显著差异(P<0.01)。经中药熏蒸治疗后，各熏蒸组IL-1ra升高的含量与模型组比较，均有显著差异(P<0.05～0.01);高熏组在IL-1ra含量升高方面与水熏组比较有非常显著差异(P<0.01)，但低熏组与水熏组比较亦无差异;低熏组与水熏组比较，前者对此指标的改善亦好于后者，但统计上未见明显差异。
       3.3 中药熏蒸疗法对CIA大鼠血清IL-1ra/IL-1β比值影响表1显示，各造模组与正常组比较均有非常显著差异(P<0.01);各熏蒸组与模型组比较亦有非常显著差异(P<0.01);各组间比较，高熏组与水熏组比较有非常显著差异(P<0.01)，低熏组与水熏组比较亦有非常显著差异(P<0.01)，高熏组与低熏组比较亦有非常显著差异(P<0.01)。表1 中药熏蒸疗法对CIA大鼠血清IL-1β、IL-1ra的含量及IL-1ra/IL-1β比值的影响
       4 讨论
       中药熏蒸疗法又称“中药熏洗疗法”“中药气浴疗法”“中药蒸气疗法”，是中国医药学的重要组成部分，它是以中医基础理论为指导，用适当的中药通过煮沸后产生的蒸汽进行熏蒸，借药力和热力直接作用于所熏洗部位，达到扩张局部血管、促进血液循环、温通血脉、消肿止痛，最后达到治病、防病、保健的目的。本法历史悠久，素为历代医家习用，是一种安全有效的外治法。
       诸多研究均证实了RA发病过程伴随着多种免疫活性细胞活化及细胞因子、炎症介质的共同参与[3]。其中，IL-1β就是其中最重要的细胞因子之一，在RA的骨侵蚀及软骨破坏中发挥重要作用[4];而白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra) 是细胞因子大家庭中第一个内源性受体拮抗剂。IL-1ra与两种IL-1R均能在细胞表面特异性地结合，阻断IL-1β在机体的免疫应答、炎症反应、感染和组织损伤中的作用，是一种理想的特异性、竞争性IL-1拮抗剂[5]。此外，Gabay等[6]通过对CIA模型大鼠的研究首次提出关节炎的活动程度与IL-1β/IL-1ra的比率相关，故体内IL-1和IL-1ra的水平保持平衡对维持稳态和预防疾病至关重要。
       RA属中医的“痹证”范畴，中医理论认为,“风寒湿三气杂至，合而为痹也。其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜者为着痹也”，故治疗我们选用祛风散寒除湿，活血化瘀通络为主的熏蒸1号方，进一步探讨中药熏蒸疗法对RA的抗炎机制，从而从细胞因子角度为中药熏蒸疗法治疗RA提供理论基础。
       本实验的结果显示各熏蒸组IL-1β含量的下降和IL-1ra含量的升高明显优于模型组,且高熏组优于水熏组，低熏组对两个指标的改善好于水熏组，但统计上未见明显差异，考虑为熏蒸时间太短，有效的药物血液浓度太低，此外，中药熏蒸的温热效应起到一定的作用。各熏蒸组在IL-1ra/IL-1β比值方面较模型组明显升高，高熏组优于低熏组，低熏组又优于水熏组。以上研究结果提示中药熏蒸疗法可能通过对细胞因子网络的调节，降低促炎性细胞因子 IL-1β，上调抗炎性细胞因子IL-1ra水平，调节IL-1ra/IL-1β比值平衡，从而抑制骨质与软骨的破坏，减轻滑膜炎性反应，达到治疗和预防RA的目的。
       【参考文献】
         　[1] 汪 元,沈 鹰.中药熏蒸对关节炎大鼠抗炎消肿作用及炎性递质的影响[J]. 安徽中医学院学报，2006，25(1)：22.
       
       [2] 陆继娣,沈 鹰. 中药熏蒸对佐剂性关节炎大鼠血清踝关节中ICAM-1的影响[J]. 山东中医药大学学报,2008,32(3):242.
       
       [3] Gay S,Renate EG,William JK,et al.Molecular and cellcular mechanism of join detruction in rheumatoid arthritis two cellular mechanisms explain joint destruction[J].Ann Rheum Dis, 1993,52(Suppl):39.
       
       [4] LEE DM ,W EINBLATT M E.Rheumatoid Arthritis[J]. Lancet,2001, 358(9258): 903.
       
       [5] 宋明娟，俞 瑾，吴根诚.白介素-1受体拮抗剂的抗炎性疼痛作用[J].国外医学·生理病理科学与临床分册，2004，24(3)：386.
       
       [6] Gabay C,Marinova Mutafchieva L,Williams RO,et al.Increased Production of intracellular interleukin-1 receptorantagonist TypeIin thesynovium of mice with collagen-induced arthritis[J].Arthritis Rheum,2000,44(2):451.