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       【摘要】 
       目的采用正交设计与星点设计效应面法两种实验设计方法，优选淫羊藿提取工艺，并对设计方法进行比较。方法以淫羊藿苷提取量为因变量，乙醇浓度、回流时间和溶剂(倍)量为自变量，优选提取工艺。结果正交实验设计确定最佳工艺是12倍量60%乙醇回流提取两次，3 h/次;星点设计效应面优化法确定最佳工艺是12倍量50%乙醇回流提取两次，160 min/次。结论星点设计-效应面法在该提取工艺研究中优于正交实验设计法，为其应用于中药提取工艺优化的可行性提供了依据。
       【关键词】  正交设计; 星点设计-效应面法; 淫羊藿苷; 提取工艺
       Abstract：ObjectiveTo optimize the process of extacting effective constituents from Epimedii Herba by orthogonal experimental design and central composite design-response surface method.MethodsIndependent variables were concentration of ethanol ,extraction time,times of reflux and solvent fold.Dependent variable was extraction rate of icariin in Epimedii Herba.Linear or nonlinear mathematic models were used to estimate the relationship between independent and dependent variables.ResultsThe result of the orthogonal experimental design was 60% ethanol,180 minutes for reflux,12 fold of solvent and 2 times for extraction.The other was 50% ethanol,160 minutes for reflux,12 fold of solvent and 2 times for extration.ConclusionThe Central Composite Design -Response Surface Method is highly predictive in experimental design.
       Key words： Orthogonal experimental design; Central Composite Design-Response Surface Method; Icariin; Extraction process
       目前国内中药的提取工艺多采取正交设计，线性数学模型进行优化，星点设计是国外常用的实验设计方法，近年国内也有用于优化处方或成型工艺的报道。该方法采用非线性数学模型拟合，在中心点进行重复性实验以提高实验精度，预测值更接近真实值。本实验采用正交实验设计和星点实验设计两种方法，优化淫羊藿的提取工艺，并比较两种实验设计方法的优缺点，为探讨不同实验设计方法应用于优化中药提取工艺的可行性提供依据。
       1 仪器与试药
       1.1 仪器紫外分光光度计(756型Spectrum，上海光谱仪器有限公司)，电子分析天平(FA1004N，上海精密科学仪器有限公司)，超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司，A S20500AT)。
       1.2 试药淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110737-200414)，淫羊藿药材(天津达仁堂药店，天津中医药大学马琳教授鉴定);甲醇(天津市康科德科技有限公司，分析纯)，无水乙醇(天津市北方天医化学试剂厂，分析纯)、纯净水。
       2 方法与结果
       2.1 淫羊藿苷含量测定方法
       2.1.1 对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷对照品1.5 mg，置25 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得60 mg·L-1的标准贮备液。
       2.1.2 供试品溶液的制备每次取淫羊藿粗粉5 g，按各实验设计条件进行提取，合并两次提取液并定容至150 ml，精密量取2 ml于蒸发皿中蒸干，加入乙醇复溶转移置25 ml容量瓶中，定容，再精密吸取供试液1 ml，置10 ml 量瓶中，乙醇稀释至刻度，摇匀。用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，取续滤液作为样品溶液备用。
       2.1.3 测定方法以甲醇为空白，于270 nm 处测定吸收度,通过标准曲线计算即得。
       2.1.4 线性关系考察分别精密吸取1.0，1.5，2.0，3.0，4.0 ml置10 ml量瓶中，加入95%乙醇稀释至刻度，摇匀，按测定方法同法处理，测定吸收值并回归。以吸收度为纵坐标，淫羊藿苷浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=0.031 9X+0.006 3，R2=0.999 9，线性范围为6～24 mg·L-1。
       2.1.5 精密度实验同一对照品溶液重复测定6次，吸收度RSD=0.38%。
       2.1.6 重复性实验按照供试品溶液制备项下方法平行6份制备，分别测定各样品吸收度RSD=1.17%。
       2.1.7 加样回收率实验称取淫羊藿药材粗粉5.0 g，共3份，分别精密加入淫羊藿苷对照品溶液适量，照供试品溶液制备项下方法制备，分别测定并计算回收率，结果平均回收率为100.79%，RSD=2.7%。
       2.2 淫羊藿回流提取工艺优化
       2.2.1 正交实验设计及结果淫羊藿总黄酮类成分可溶于水、甲醇，易溶于乙醇，本实验采用乙醇回流法进行提取，选用乙醇的浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数为4个因素，每个因素选3个水平，用L9(34)正交实验设计表安排实验，以总黄酮(淫羊藿苷)的含量为评价指标。在进行正交实验设计时，根据生产实际，周期一般不宜过长，将提取次数这一考察因素确定为提取2次，实验因素水平设计及试验结果见表1～2。表1 实验因素水平表L9表2 正交实验表表3 方差分析表验证实验：在确定优化工艺后，进行3次验证实验。结果如表4。表4 验证实验
       2.2.2 星点实验设计及结果以乙醇浓度、提取时间及溶剂用量为影响因素，提取次数暂定为2次，根据星点设计的原理，各因素的水平设计见表5，实验安排与结果见表6。表5 因素水平表表6 星点实验设计与结果
       2.2.3 模型拟合 以淫羊藿苷含量为因变量使用SPSS软件对各因素进行多元线性回归和二项式拟合。拟合模型如下。　　多元线性回归：Y=b0+b1X1+b2X2 +b3X3二项式拟合:Y=b0+b1 X1+b2 X2+b3 X3+b4 X12+b5 X22+b6 X32+b7 X1 X2+b8 X1 X3+b9 X2 X3根据结果分析，多元线性回归：Y=4.948-0.021X1+0.011X2+0.026X3，r=0.867，*P<0.01。虽然模型通过检验，但是拟合度不佳，预测性较差，采用二项式拟合。结果见表7。表7 二次多项式非线性估计结果模型的复相关系数r=0.994，剔除最不可信的b2和b7项，再重新拟合。结果见表8。表8 简化后二次多项式非线性估计结果
       2.2.4 工艺参数优化和预测把因变量与另两因素拟合为三维曲面图，因只能表达含两个因素变量的函数，故固定3个变量中的一个为中值，再以拟合的目标函数为数学模型，绘制因变量曲面图(见图1～3)，在图上选取较佳工艺范围X1：50%～60%，X2：12～14倍，X3：160～200 min，综合考虑工业生产中的实际情况，故选取提取淫羊藿中淫羊藿苷的最佳工艺为：12倍量50%乙醇回流提取2次，160 min/次。
       根据优选出的提取工艺(12倍量50%乙醇提取两次，160 min/次)进行3次验证实验，比较预测值与真实值，结果如下：预测值为6.30%，平均测得值为(6.15%+0.05)%，RSD=0.8%，预测值与真实值之间的偏差为-2.32%。图1 溶剂倍量和提取时间对淫羊藿苷含量影响三维曲线图2 乙醇浓度和溶剂倍量对淫羊藿苷含量影响三维曲线图3 乙醇浓度和提取时间对淫羊藿苷含量影响三维曲线
       3 讨论
       实验设计是指对试验事先作出周密的设想与合理安排，以便达到预期的目的。正交实验设计是用正交表来安排试验，正交表的构造具有“均匀分散，整齐可比”的特点，正交实验为了达到整齐可比，在同样多的因素水平条件下，试验次数与星点设计相比较往往比较多，一般很难实现。
       而星点设计是多因素5水平的实验设计，是在2水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成的。设计中还有一定数量的中心点重复试验，中心点的个数与星点设计的特殊性质如正交或均一精密有关。在均一精密的星点设计中，y的原点方差与离原点单位距离时的方差相等，与正交设计相比，能更好地避免回归系数发生偏差,使回归操作更可靠。
       本实验两种实验设计方法所优化工艺条件基本相近，星点设计效应面优化法精度更高。因为，一般效应值在最佳实验条件区域附近变化比较灵敏，实验条件的微小变化均可造成效应值的大幅变化，适合于用非线性模型拟合，并且随着实验条件远离较优区，效应面弯曲度逐渐减小，愈远离，线性愈好。该现象的启示是，正交设计法在模型拟合时，线性相关系数愈大，表明因素水平的选择离最优区愈远(效应与因素之间关系呈线性的除外，但完全线性关系较少，这与优化的目的背道而驰)。相反，如果相关性不好，排除获得实验数据的误差外，可能是因为所选因素水平范围正好在较优区附近，面弯曲度较大，但正交设计优化法所得分析结果一般认为优化失败。如果改用适用于非线性模型的实验设计优化法，相关系数可能会有很大的提高;另外正交设计受所选线性模型的限制，只能指出某一因素的取值方向，无法求得极值，往往选择的条件均接近自变量的极大或极小值。而星点设计效应面优化法在最佳条件下效应的预测值和实测值偏差较小。
       综上所述，星点设计效应面优化法在实验设计精度上优于正交试验设计，为其应用于中药提取工艺优化的可行性提供了依据，而正交实验设计凭借其处理结果简便的优点也有不可替代的优势，可为星点设计效应面优化法提供一定的参考。
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