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       【摘要】 
       目的研究马齿苋黄酮的抑制脂肪堆积和抗氧化能力。方法用前脂肪细胞模型及羟基自由基抗氧化模型测定马齿苋黄酮体外影响前脂肪细胞3T3-L1增殖及其清除羟自由基能力。结果高浓度马齿苋黄酮(>200 μg/ml)极显著抑制前脂肪细胞3T3-L1增殖。当马齿苋黄酮浓度大于0.061 mg/ml，随浓度增加，其清除羟自由基能力增强;浓度为0.119 mg/ml时清除率达50%，相当于0.130 mg/ml的维生素C溶液。结论马齿苋黄酮有较强体外清除羟自由基能力，高浓度(>100 μg/ml)时具有显著抑制前脂肪细胞3T3-L1增殖的能力。
       【关键词】  马齿苋黄酮; 3T3-L1; 增殖; 清除羟自由基
       Abstract：ObjectiveTo study the antioxidant and fat inhibitory ability of Portulaca oleracea L. Flavonoids. MethodsInhibitory activity to Preadipocyte proliferation and antioxidant activity of flavonoids extracted from portulaca oleracea L. were detected.ResultsThe results showed that Portulaca oleracea L. flavonoids exerted significant inhibitory activity on preadipocytes 3T3-L1 proliferation at the concentration higher than 200μg/ml. Furthermore, it showed higher hydroxyl radicals scavenging capability with the increase of concentration at the concentration higher than 0.061mg/mL, besides, showed the same capability of scavenging half of hydroxyl radicals at the concentration of 0.119mg/ml compared with 0.13mg/ml Vitamin C.ConclusionPortulaca oleracea L. Flavonoids has strong OH. Scavenging ability and can signifigantly inbibit 3T3-L1 proliferation at high concentration(>100μg/ml) .
       Key words：Portulaca oleracea L. Flavonoids; 3T3-L1; Proliferation; Scavenging hydroxyl radicals
       马齿苋 portulaca oleracea L.又名瓜子菜，为马齿苋科马齿苋属植物，我国从南到北均有生长，其资源极为丰富。近年来国内外学者发现马齿苋具有多种药理作用[1]，如抗菌抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗心血管疾病，增强免疫力等。马齿苋黄酮是马齿苋中生理活性成分之一，目前关于马齿苋黄酮功效的研究尚少。本文通过3T3-L1细胞模型及抗氧化试验考察马齿苋黄酮体外抑脂及清除羟自由基能力，为进一步开发马齿苋活性成分提供理论基础。
       1 材料与仪器
       1.1 材料新鲜马齿苋Portulaca oleracea L.于2007-09购于南昌市农贸市场，经本校药学院药理学教研室鉴定。用清水洗净沥干，60℃干燥，粉碎成末备用。细胞株：3T3-L1细胞购自北京协和医院。高糖DMEM培养液，购自GIBICO;胎牛血清，购自杭州四季青;L-谷氨酰胺，HEPES，胰蛋白酶，MTT(溴化二甲噻唑二苯四氮唑)，DMSO(二甲基亚砜)均购自AMERESCO;其它试剂均为国产分析纯(国药集团)。
       1.2 仪器倒置荧光显微镜(IX-71：日本OLYMPUS);二氧化碳培养箱(Thermo Forma Series-Ⅱ，美国Thermo);全自动酶标仪(Multiscan Mk3，Labsystems)，紫外分光光度计UV2000(上海)。
       2 方法
       2.1 马齿苋黄酮的提取
       2.1.1 黄酮提取参照周春丽等[2]的研究方法。
       2.1.2 黄酮标准曲线采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法测定总黄酮，精确称取芦丁标准品8mg，至50 ml量瓶中，加60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得芦丁标准溶液。用移液管准确吸取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 ml的芦丁标准液分别置于10 ml的容量瓶中，加入水2～4 ml，加入5%亚硝酸钠0.3 ml，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝0.3 ml，摇匀，放置6 min，加入1.0 mol/L氢氧化钠4.0 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，在510 nm处测定吸光值A。用最小二乘法做线性回归，求得芦丁浓度与吸光度A的关系曲线。
       2.2 MTT法测定马齿苋黄酮对前脂肪细胞3T3-L1增殖的影响取对数生长期的3T3-L1细胞，0.125%胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞浓度。将细胞接种于96孔细胞培养板，37℃，5%CO2培养2 d。弃去孔中培养液，添加含不同浓度(25，50，100，200μg/ml)马齿苋黄酮(溶于DMSO)的培养液，对照组为含0.1% DMSO的培养液，每种样品每个浓度设3个平行，培养24h后测定马齿苋黄酮对细胞的抑制值。每孔加入20 μl MTT液， 37℃继续培养4 h，弃去孔中液体，每孔加入150 μl DMSO，充分振荡，在酶联免疫检测仪上测定492 nm处吸光度。抑制率计算如下式：细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组A492值/对照组A492值)×100% 。
       2.3 体外抗氧化试验-清除羟自由基活性[3]利用 H2O2和 Fe2+混合发生 Fenton反应生成·OH，在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在 510 nm处有最大吸收。如加入具有清除作用的物质，便会与水杨酸竞争，使有色产物生成量减少。本实验在试管中依次加入6 mmol/l FeSO4 2 ml、分别加0.2 mg/ml马齿苋黄酮溶液0，0. 1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml并补足至2 ml，6 mmol/L H2O2 2 ml，摇匀，静置 10 min，再加入 6 mmol/L水杨酸溶液 2 ml，摇匀，静置30 min后于 510 nm处测得不同黄酮浓度下的光密度 Di ;用水代替水杨酸测得黄酮的本底光密度Dj;用水代替抗氧化剂时测得空白对照光密度 D0。阳性对照组为添加对应量的1.0 mg/ml维生素C。清除率按下式计算：清除率S(%)=1-( Di- Dj)/ Do×100%
       2.4 数据处理实验所得数据以±s表示，用SPSS13.0 进行单因素方差分析与显著性检验。
       3 结果
       3.1 马齿苋黄酮的提取芦丁标准曲线见图1。图1 芦丁标准曲线用最小二乘法作线性回归得芦丁浓度与吸光值关系回归方程A=11.32C - 0.012 5，R2 = 0.998 8 (A为吸光值，C为芦丁浓度)，根据方程得样液中黄酮含量为0.22 mg/ml。
       3.2 MTT法测定马齿苋黄酮对前脂肪细胞3T3-L1的影响MTT比色法是目前广泛采用的检测细胞生长和存活的方法，其原理是：活细胞内的线粒体内琥珀酸脱氢酶能将黄色的MTT裂解为蓝紫色甲臜，而死细胞则无此功能。甲臜的量以492 nm条件下吸光度A值来反映，在一定细胞范围内，A值与活细胞数成正相关，从而间接反映细胞的生长增殖状况。表1 马齿苋黄酮对3T3-L1细胞增殖的影响表1结果显示，浓度>100 μg/ml马齿苋黄酮处理组与空白对照组相比有显著差异(P<0.05)。在高浓度(200 μg/ml)时具有极显著差异(P<0.001)。从图2可看出马齿苋黄酮具有较强的抑制前脂肪细胞3T3-L1增殖的能力。马齿苋黄酮抑制能力呈浓度依赖性，随着浓度增大抑制能力增强，特别是在200 μg/ml时两者对3T3-L1的抑制率分别为79.75%，超过了半数抑制浓度(IC50)。3.3 体外抗氧化试验——清除羟自由基能力马齿苋黄酮自由基清除率见图3。图2 马齿苋黄酮对前脂肪细胞3T3-L1的抑制率图3 马齿苋黄酮对羟基自由基的清除作用图3可见当马齿苋黄酮浓度大于0.061 mg/ml(即0.275 ml×0.22 mg/ml)，随浓度增加清除羟自由基能力增强，黄酮浓度为0.119 mg/ml(即0.54 ml×0.22 mg/ml)时其清除率相当于0.130 mg/ml维生素C达到50%。
       4 讨论
       黄酮类化合物广泛存在于植物资源中，其生理作用一直受到人们关注，国内外研究表明其具有清除自由基、预防治疗心脑血管疾病、抗病毒等作用[ 4,5 ]。马齿苋是药食两用植物，本研究通过提取其黄酮，发现马齿苋黄酮具有较强的清除羟自由基的能力，为开发马齿苋黄酮成为抗氧化功能食品提供了一定的依据。王晓波等[6]用动物模型发现马齿苋水提液具有调节脂质代谢作用，本研究通过细胞实验发现高浓度(>100 μg/ml)马齿苋黄酮具有显著抑制前脂肪细胞3T3-L1增殖能力，由此推断马齿苋调节脂质代谢作用可能与马齿苋中的黄酮成分有关，但之间的联系及机理还需要通过动物实验、分子生物学等手段进一步的研究确认。
       【参考文献】
         　[1] 丁怀伟，姚佳琪，宋少江.马齿苋的化学成分和药理活性研究进展[J].沈阳药科大学学报，2008,25(10):831.
       
       [2] 周春丽，苏 虎，李玉萍，等.马齿苋有效成分的提取及定量分析[J].时珍国医国药，2008，19(8):3391.
       
       [3] 朱晓宦，吴向阳，仰榴青，等. 马齿苋粗多糖的提取及清除羟自由基活性作用[J]. 江苏大学学报 (医学版 )，2007，17( 1):84.
       
       [4] 余燕影，章丽华，曹树稳.丰城鸡血藤黄酮提取物清除自由基活性研究[J]. 天然产物研究与开发，2007，19: 741.
       
       [5] Spinozi F. The natural tyrosine kinase inhibitor enistein produces cell cycle arrest and apoptosis in Jurkat Fleukemis cell [J] .Leuk Res，1994，18: 431.
       
       [6] 王晓波，刘殿武，王本华，等. 马齿苋对高脂动物血脂及脂质过氧化作用的干预实验研究[J].河北医科大学学报，2003，24 (5):162.