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       【摘要】 
       目的建立测定齐墩果酸血浆浓度的HPLC方法，研究唐古特青兰醇提取物中齐墩果酸的药代动力学规律。方法采取甲醇-水(85∶15，V/V)为流动相，Diamonsil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)为固定相，紫外检测波长为215 nm测定，大鼠灌胃给药3.0，1.5 g/kg，用HPLC法测定给药大鼠血浆中齐墩果酸的含量，采用药代动力学软件DAS(ver2.0)处理，得到齐墩果酸的药代动力学参数。结果大鼠灌胃高剂量和低剂量给药的齐墩果酸主要参数分为AUC0-t 为49 450.915 mg/( L·min)和37 336.884 mg/( L·min)，tl/2为85.154 min和55.215 min。结论齐墩果酸在大鼠体内的代谢符合一室模型，吸收、消除较快。
       【关键词】  唐古特青兰; 齐墩果酸; 药代动力学; 高效液相色谱
       唐古特青兰又名甘青青兰( Dracocephalum tanguticum Maxim，简称DtM)，藏文译音“知羊格”，是藏医常用药材，属多年生唇形科草本植物，生长在海拔1 900～4 600 m的青藏高原。其性寒、味甘苦，可清肝胃之热，用于治疗胃炎、肝炎、头晕、关节炎、胃溃疡、神疲等[1]，主含黄酮苷、挥发油、氨基酸、甾类、齐墩果酸、熊果酸、胡萝卜苷等[2]。研究发现，DtM的醇提液可以有效降低大鼠的血糖浓度，具有降血糖的药理作用，DtM水提液可升高缺氧动物红细胞 SOD含量、清除氧自由基，降低整体耗氧量，具有抗心脑组织缺氧的作用，可改善缺氧造成的血液流变学异常、血小板减少、右心室肥厚及组织病理学损伤。其药用价值显著，但目前对唐古特青兰用于治疗这方面疾病的研究不少，大多数对其在体内的代谢还不清楚，或仅限于理论上的论述，不便于对其进行研究和利用，且未见文献报道。为此我们对DtM的醇提液中齐墩果酸在大鼠体内的代谢进行药代动力学研究。
       1 材料与仪器
       1.1 动物 健康Wistar雄性大鼠12只，体质量(250±50)g，由四川省实验动物中心提供，合格证号：SCXK[川]2008-14。
       1.2 仪器 岛津LC-10AT高效液相色谱仪;Diamonsil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);SPD-M10Avp UV-VIS检测器;CTO-1OA柱温箱;C-R7Ae色谱数据处理仪;SIL-1OADvp自动进样器;旋转蒸发仪(上海夏丰实业有限公司);精密天平(沈阳龙腾电子有限公司);台式高速离心机;HY调速多用振荡仪(江苏正基仪器有限公司);YGL系列氮吹仪(成都雅源科技有限公司);微孔滤膜(0.45 μm)。
       1.3 试剂及药品 甲醇;醋酸乙酯;无水乙醇;高纯水(自制);肝素;唐古特青兰(采自青海，经成都中医药大学中药室鉴定为唇形科植物唐古特青兰的带根全草。)
       1.4 药物的制备 取115 g原药材，加入700 ml 95%的乙醇溶液中，加热煮沸2h，过滤，通过旋转蒸发仪回收乙醇，浓缩成相当于生药量0.45，0.90g/ml的溶液，保存备用。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件Diamonsil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-水(85∶15，V/V);柱温30 ℃ ;流速 1.0 ml/min;检测波长215nm。
       2.2 血样处理 在100 μl血浆加入0.1 ml乙酸乙酯，振荡5 min，6 000 r/min离心，取上清液，加0.3 ml甲醇沉淀蛋白，振荡5 min，6 000 r/min离心，取上清液，50℃氮气吹干。用1.0 ml流动相溶解，取10 μl进样分析，测定峰面积。
       2.3 对照品溶液的制备 取对照品恒温干燥至恒质量，精密称取5.0 mg 齐墩果酸对照品，置5.0 ml容量瓶中，用流动相溶解，超声5 min，定容至5.0 ml，得到1.0 mg/ml 对照品溶液。
       2.4 标准曲线的制备 精密量取大鼠空白血浆0.1 ml，分别加入齐墩果酸标准品，配制成血浆浓度分别为:10，20，30，40，50 μg/ml血浆溶液,按上述血样处理过程处理，分别取10 μl进样，记录峰面积，以峰面积值(Y)对齐墩果酸的浓度(X)进行线性回归。
       2.5 精密度实验取大鼠空白血浆0.1 ml，用标准品配制成浓度分别为10，20，40 μg/ml的血浆溶液，按“2.2”项操作，测定样品峰面积。代入标准曲线方程，计算测得浓度，考察日内和连续5d的日间变异情况。
       2.6 回收率实验分别用空白血浆配制齐墩果酸质量浓度为10，20，40 μg/ml，的样品， 按“2.2”项操作，测定样品峰面积。代入标准曲线方程，计算测定浓度。
       2.7 动物实验大鼠给药前禁食，自由摄水，实验随机分为两组,每组6只，分别为高、低剂量组。按3.0 g/kg, 1.5 g/kg灌胃给药。给药后5，10，20，30，45，60，90，120，180，240，360 min后分别于尾静脉取血，每次取血0.5 ml于肝素处理的离心管中，离心，取100 μl上清液，按“2.2”项操作。
       2.8 药动学参数计算 所得血药浓度-时间( C-T)数据用药代动力学分析软件DAS(ver2.0)程序处理。
       3 结果
       3.1 线性关系 以峰面积值(Y)对齐墩果酸的浓度(X)进行线性回归，得回归线方程：Y=3 089.5X-6 481.2，r=0.999 09。结果表明齐墩果酸在10～50 μg/ml关系良好，保留时间为23.3 min，齐墩果酸色谱图见图1。
       3.2 精密度实验从表l可知该方法精密度好，日内及日间误差(RSD)都比较小。
       3.3 回收率实验 由表2可知，高、中、低3个质量浓度的回收率均大于90%。
       3.4 动物实验结果 将实验所得齐墩果酸的血药浓度-时间数据，经药代动力学分析软件DAS(ver2.0)处理，经由计算机进行曲线拟合，得唐古特青兰醇提取物中齐墩果酸在健康大鼠体内的药代动力学参数(见表3～4)及药-时曲线图(见图2)。结果显示，大鼠灌胃给药后，齐墩果酸在血液里60 min时达到最高血药浓度。高低剂量对比，药-时曲线线性关系良好，所得最佳房室数为一室，权重系数为1，清除率基本一致。图1 齐墩果酸色谱图表1 齐墩果酸在大鼠血浆中的精密度实验结果表2 齐墩果酸在大鼠血浆中的回收率实验结果
       4 讨论
       4.1 分析方法学 齐墩果酸易溶于甲醇、醋酸乙酯、氯仿中，经反复试验，并参考文献，当采用醋酸乙酯萃取血浆样本时，萃取效率较高，且内源性物质对齐墩果酸测定干扰小。 本文建立HPLC法测量齐墩果酸在血浆中含量，方法稳定、灵敏度高、专属性强，杂质干扰小，操作简便，回收率和精密度实验的RSD均比较低，是一种比较理想的方法。表4 齐墩果酸在大鼠血液里的药代动力学参数图2 药-时曲线图
       4.2 药代动力学 对大鼠灌胃唐古特青兰的醇提物齐墩果酸，血药浓度-时间数据经DAS(ver2.O)药代动力学分析软件处理，所得最佳房室数为一室，权重系数w为1，采用高剂量组和低剂量组灌胃给药，这两种剂量的半衰期，清除率基本一致，同时无观察到毒性反应现象，说明给药剂量合理，线性关系良好。综上所述，唐古特青兰在大鼠体内药代动力学规律明显，吸收、消除较快，代谢迅速，所得结果可为临床合理用药提供科学依据。
       【参考文献】
         　[1] 徐中海.甘青青兰挥发油成分超临界二氧化碳萃取与气相色谱-质谱分析[J].中医药导报,2008,14(8)：12.
       
       [2] 李霁昕,贾忠建.甘青青兰化学成分的研究[J].西北植物学报,2006,26(1):188.