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       【摘要】 
       目的建立南五味子(包括醋南五味子)具有专属性的薄层色谱(TLC)鉴别方法，并完善南五味子的质量标准。方法以安五脂素为对照品，磷钼酸试液加热显色，进行南五味子和五味子的TLC鉴别;测定并提出南五味子的水分和总灰分限度;采用高效液相色谱(HPLC)法测定南五味子中五味子酯甲的含量，并计算干燥品的含量限度。结果安五脂素在南五味子药材及醋南五味子薄层色谱中显色清晰，五味子色谱中无安五脂素斑点;南五味子的水分和总灰分醋制前后均在12.0%和6.0%以内;按干燥品计算，南五味子药材中五味子酯甲含量为0.28%～0.80%，醋南五味子中五味子酯甲含量为0.25%～0.87%。结论新建的薄层色谱方法适用于南五味子药材和醋南五味子的鉴别，专属性强;以干燥品中五味子酯甲的含量评价南五味子质量，准确可靠。
       【关键词】  南五味子; 醋南五味子; 安五脂素; 薄层色谱鉴别; 质量标准
       南五味子为木兰科植物华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils. 的干燥成熟果实，曾与同属五味子S. chinensis (Turcz.) Baill.的果实共同作为五味子药材使用，因两者在化学成分种类及有效成分含量上的显著差异[1]，《中国药典》自2000年起将南五味子(Fructus Schisandrae Sphenantherae, Nan- Wuweizi)和五味子(Fructus Schisandrae Chinensis, Wuweizi)分别收载。但在现行药典标准中，南五味子仍采用与五味子完全相同的对照品(五味子甲素)和色谱条件进行薄层色谱(TLC)鉴别，缺少专属性和特征性;而且含量测定项下五味子酯甲的含量限度未按干燥品计算，不够准确;对炮制品醋南五味子仅规定了制法和性状特征[2]。为了有效的鉴别和质量控制，本文以特征性成分安五脂素为对照品，建立了南五味子专属性的TLC鉴别方法;测定了水分和总灰分;以优化的HPLC色谱条件，测定了干燥品中五味子酯甲的含量;同时采用相同的方法系统建立了醋南五味子的质量标准，以期为南五味子质量标准的完善和提高提供参考。
       1 仪器与试药
       Agilent 1100型高效液相色谱仪，DAD紫外检测仪，Hpcheme色谱工作站;SHANGPING FA1004 天平(上海天平仪器厂);ZX98-1旋转蒸发仪(中国科学院上海有机化学所);电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂);DL-360超声波清洗器(上海之信仪器有限公司);SRJX-3-9箱式电阻炉(上海鼎奇实业有限公司)，水分测定仪(上海同歆生物医药科技有限公司)。
       硅胶GF254薄层板(10 cm×20 cm，烟台市芝罘黄务硅胶试验厂);南五味子对照药材(批号121118-200502)、五味子对照药材(批号120922-200606)、五味子酯甲对照品(批号11529-200503)购自中国药品生物制品检定所;安五脂素、五味子甲素对照品为本课题组自制，经HPLC-ELSD检测，纯度均达到95%以上;10批次南五味子药材收集情况见表1，经笔者鉴定均为华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils.的干燥成熟果实，凭证样本保存于本教研室;10批醋南五味子饮片由以上南五味子样品分别按相同醋蒸工艺炮制所得;HPLC所用甲醇、四氢呋喃为色谱纯，水为市售纯净水，其余试剂均为分析纯。表1 10批南五味子药材来源
       2 方法与结果
       2.1 TLC鉴别
       2.1.1 南五味子TLC鉴别取本品粉末1 g，加环己烷10 ml，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，滤过，滤液蒸干，加入甲醇2 ml溶解，离心(5 000 r/min)2 min，取上清液蒸干，加环己烷1 ml使溶解，作为供试品溶液。分别取南五味子对照药材、五味子对照药材各1 g，同法制成对照药材溶液。再取安五脂素、五味子甲素对照品，分别加环己烷制成每毫升含2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述5种溶液各2 μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-丙酮(60∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254 nm)下检视，南五味子供试品、南五味子对照药材和五味子对照药材色谱中，在与五味子甲素色谱相应的位置上，均显相同暗斑;在与安五脂素色谱相应的位置上，仅南五味子供试品和对照药材色谱显相同暗斑，但较模糊见图1a。将薄层板取出，再喷以磷钼酸试液，105℃加热至斑点显色清晰，南五味子供试品和对照药材色谱中，在与安五脂素色谱相应的位置上，显相同的深蓝色斑点;五味子对照药材色谱中，在与安五脂素色谱相应的位置上，仍无任何斑点见图1b。
       2.1.2 醋南五味子TLC鉴别采用上述相同的方法对醋南五味子进行TLC鉴别，供试品溶液色谱中，在与南五味子对照药材和安五脂素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
       2.2 水分及总灰分测定南五味子中含有丰富的挥发油，故水分测定采用《中国药典》2005年版(Ⅰ部)附录Ⅸ H水分测定法第二法(甲苯法)进行;总灰分测定按《中国药典》2005年版(Ⅰ部)附录Ⅸ K灰分测定法进行。10批药材及饮片的水分、总灰分测定结果见表2。根据测定结果，建议南五味子和醋南五味子的水分不得超过12.0%，总灰分不得超过6.0%。1～10：10批南五味子药材，S1：南五味子对照药材，S2：安五脂素对照品，S3：五味子甲素对照品，S4：五味子对照药材图1 南五味子的TLC图
       2.3 南五味子的HPLC含量测定
       2.3.1 色谱条件及系统适应性Phenomenex Luna 5 μm C18(2) (250 mm×4.6 mm);预柱：Security Guard Cartridges C18(3.0 mm×4.0 mm);流动相为四氢呋喃-水(38∶62);流速1 ml/min;柱温40 ℃;检测波长254 nm;进样量20 μl。对照品与样品色谱图见图2。图2 五味子酯甲对照品(A)、南五味子(B)和醋南五味子(C)的HPLC图
       2.3.2 对照品溶液的制备精密称取五味子酯甲对照品5.8 mg，置5 m1量瓶中，用少量甲醇加热溶解，冷却至室温后加甲醇制成每毫升含1.16 mg的溶液，作为对照品贮备液。
       2.3.3 供试品溶液的制备取南五味子样品粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25 ml，浓缩并定容至10 ml，离心，即得。
       2.3.4 标准曲线的建立精密吸取五味子酯甲对照品贮备液适量，加甲醇制成含五味子酯甲11.4，28.5，57，85.5，142.5，285，570 μg/ml的溶液，分别吸取20 μl进样测定。以进样质量为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得回归方程：A=22.71C+10.65，r=0.999 9，结果表明五味子酯甲在0.228～11.4 μg与峰面积呈良好的线性关系。
       2.3.5 检测限与定量限采用信噪比法，将对照品溶液逐步稀释至约3、10倍噪音的浓度，结果表明，检测限为2.03 μg /ml;定量限为6.96 μg /ml， RSD值为1.35%。
       2.3.6 精密度实验取同一份对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，以峰面积积分值平均值计算，五味子酯甲的RSD值为2.57%;取9号样品粉末制备供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，以峰面积积分值平均值计算，五味子酯甲的RSD值为2.58%。结果表明方法精密度良好。
       2.3.7 稳定性实验取9号南五味子样品粉末0.5 g，按“2.3.3”项下方法，制备供试品溶液，分别于1，2，3，4，5 d进样，计算五味子酯甲含量，其RSD值为2.79%，表明样品在5 d内稳定性良好。
       2.3.8 重复性实验取9号药材样品粉末0.5 g，精密称定，按“2.3.3”项下方法，分别制备6份供试品溶液，进行HPLC分析，测定五味子酯甲的平均含量为0.42%，RSD值为3.50%。结果表明方法重复性良好。
       2.3.9 加样回收率实验取6个具塞锥形瓶，分别精密加入浓度为0.96 mg/ml的对照品溶液1ml，于水浴上蒸干后，取9号样品6份，每份约0.25 g，精密称定，按“2.3.3”项下方法，制备供试品溶液，测定五味子酯甲的含量，并计算加样回收率，平均加样回收率为100.7%，RSD值为2.20%。
       2.3.10 样品测定取各批次南五味子样品，每批3份，按“2.3.3”项下方法，制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，测定五味子酯甲的含量，并按干燥品计算样品的五味子酯甲含量。结果见表2。根据10批药材的测定结果，建议南五味子干燥品含五味子酯甲不低于0.20%。
       2.4 醋南五味子的HPLC含量测定采用“2.3.3”项下相同的条件测定了10批醋南五味子样品中五味子酯甲的含量，样品色谱图(见图2)，平均加样回收率为103.0 %，RSD值为1.07 %，样品含量测定结果见表2。根据10批饮片的测定结果，建议醋南五味子干燥品含五味子酯甲不低于0.20%。
       3 讨论
       五味子S. chinensis (Turcz.) Baill.和华中五味子S. sphenanthera Rehd. et Wils. 的果实传统上均作为药材五味子使用，临床应用并无区分。但研究表明，两者在化学成分上有明显差异 [1]，说明两者的质量和疗效应有不同。因此，《中国药典》2000年版起将S. chinensis和S. Sphenanthera的果实分别以“五味子”和“南五味子”收载，并分别以主要活性成分五味子醇甲和五味子酯甲作为定量指标，但两者薄层色谱鉴别方法仍完全相同，不能有效鉴别。本文采用南五味子区别于五味子的特征性成分安五脂素[3,4]为对照品、经磷钼酸试液加热显色进行南五味子的TLC鉴别，特征明显、专属性强，可作为南五味子药材及醋南五味子的定性鉴别方法。表2 南五味子(S)及醋南五味子(V)水分、总灰分和HPLC含量测定结果水分测定结果表明，南五味子药材含水量在6.76%～10.61%不等，本文对现行南五味子药典标准含量测定项下的HPLC条件进行了适当优化，测定了干燥品中五味子酯甲的含量，提高了南五味子质量评价的准确性。五味子酯甲为南五味子保肝降酶的主要活性成分之一。HPLC含量测定结果表明， 6批南五味子药材样品醋制后五味子酯甲含量均有不同程度的提高。醋南五味子保肝作用较强[5]，可能与醋制后保肝降酶的活性成分含量有所提高有关。
       【参考文献】
         　[1] Lu Y，Chen D F.Analysis of Schisandra chinensis and Schisandra sphenanthera [J].Journal of Chromatography A，2009，1216(11)：1980.
       
       [2] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[ S].北京：化学工业出版社，2005：169.
       
       [3] 高建平，王彦涵，郁韵秋，等.南五味子木脂素类成分的HPLC含量测定及其变异规律[J]. 中国天然药物，2003，1(2)：89.
       
       [4] 王彦涵，高建平，陈道峰.高效液相色谱法测定五味子属药用植物木脂素的含量 [J].中国中药杂志，2003，28(12)：1155.
       
       [5] 宋小妹，冯改利，宋莎莎，等.醋制对南五昧子药理作用的影响 [J].陕西中医学院学报，2009，32(2)：59.