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       【摘要】 
       目的提高盾叶薯蓣药材的品质。方法通过组织培养，对辐射诱变获得的盾叶薯蓣株系进行了抗氧化酶活性及薯蓣皂苷元含量分析。结果经诱变获得的株系SOD、POD比活力和APX活性与对照株系相比差异很大，大部分辐射诱变株系薯蓣皂苷元含量都超过了对照株系，但试管苗与一年生苗薯蓣皂苷元含量相关性不明显。结论 经诱导获得的辐射诱变株系在清除活性氧能力及有效成分含量方面与对照表现出明显差异，说明辐射诱变可以作为盾叶薯蓣优良品种选育的途径。
       【关键词】  盾叶薯蓣; 辐射诱变; 抗氧化酶活性; 薯蓣皂苷元
       盾叶薯蓣D. zingibiernsis C.H.Wright.属薯蓣科薯蓣属根状茎，又名黄姜、火头根，其根茎内薯蓣皂素的含量一般为2%左右，是目前世界上最好的激素类药源植物。同时具有清肺止咳、利湿通淋、通络止痛、解毒消肿的功能，可治肺热咳嗽、湿热淋痛、风湿腰痛、痈肿恶疮、跌打扭伤、蜂螯虫咬;其水溶性甾体皂苷成分对心肌缺血、胸痹、高脂血症等有明显治疗作用。
       盾叶薯蓣是我国特有资源植物，是世界上薯蓣皂素含量最高的种类，最高单株达到16.5%，超过了世界王牌-墨西哥小穗花薯蓣15%的纪录。据调查我国10个省市都有盾叶薯蓣分布，其中湖北、湖南、陕西、四川分布最为集中，目前在陕西安康地区、湖北郧西地区、湖南安化地区、河南南阳地区都有一定规模的种植面积。实现人工栽培后，虽然解决了皂素供应问题，而原料依旧短缺，主要原因是产量低、皂素含量变化较大，质量难以控制。因此有必要进行品种选育和提纯复壮的工作。
       细胞在正常代谢活动中和在不利的环境条件下均能产生活性氧。生物体经过长期进化形成了完善和复杂的抗氧化保护系统来清除活性氧。但当产生的活性氧超出活性氧清除系统的能力时，就会产生氧化损伤，导致膜脂过氧化、碱基突变、DNA链断裂和蛋白质损伤。因此，植物中清除活性氧能力的相关酶含量和活性的测定和筛选，在优良品种选育中具有重要参考价值。鉴于此，笔者利用组织培养技术进行了盾叶薯蓣辐射诱变育种，并对诱变株系叶片中超氧化物歧化酶(SOD)，抗坏血酸过氧化物酶(APX)，过氧化物酶(POD)3种抗氧化酶的活性及薯蓣皂苷元含量进行了分析，为盾叶薯蓣优良株系的选育提供依据。
       1 材料与仪器与方法
       1.1 材料盾叶薯蓣愈伤组织在MS+BA0.05 mg/L+PP333 0.5 mg/L培养基上分化的丛生牙作为幅射材料。
       1.2 仪器和试剂BECKMAN DU-600分光光度计，水浴锅，微量加样器。酶提取液： pH 7.5的0.05 M 的Tris-HCl缓冲液，PBS pH(7.0)，0.1mmol/L EDTA， 0.1 mmol/L H2O2， 0.5 mmol/LASA，丙酮，SOD试剂盒(购于建成生物试剂研究所)。2 方法
       2.1 辐照株系的建立用不同剂量的钴60辐照盾叶薯蓣的丛生芽，30 d后统计存活率，对存活芽进行扩大繁殖，并淘汰长势较弱，生长畸形的植株。
       2.2 SOD，POD，APX活性的测定精密称取生长30 d的辐照株系与未辐照株系试管苗新鲜叶片1.0 g，每份材料加5 ml预冷的提取缓冲液(pH7.5的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液)及少量石英砂，置于冰浴中研磨后，4 ℃冷冻离心机6 000 r/min离心10 min，上清液即为酶提取液。SOD活性按试剂盒说明书操作。POD总活力按文献[1]的方法进行，酶的比活力用ΔOD470/ (mg·min)(protein)表示。APX活性参照文献[1]的方法，酶活单位定义为每小时氧化μmol ASA的酶量为一个酶活单位。
       2.3 盾叶薯蓣试管苗薯蓣皂苷元含量分析[2，3]盾叶薯蓣试管苗在MS/2+IAA0.2 mg/L+NAA0.2 mg/L培养基上诱导生根，待苗长至30～35 d左右，洗净根上的培养基，将根剪掉，在60 ℃下烘干，粉碎，过60目筛，供含量分析用。
       2.3.1 薯蓣皂苷元的测定供试品溶液制备：精密称取盾叶薯蓣粉末0.7～1.0 g，置于三角瓶中，加2.0 mol/L的硫酸50 ml，在100℃水浴锅中水解4 h，放冷过滤，药渣用蒸馏水洗至中性，60 ℃干燥后，用石油醚(60～90℃)50 ml在90℃水浴中索氏提取5 h，提取液回收至干后用无水乙醇溶解，过滤至5 ml的容量瓶中，用无水乙醇定容待测定。对照品溶液制备：准确称取薯蓣皂苷元标样0.001 g，置2 ml容量瓶中，用无水乙醇溶解，稀释至刻度，得0.5 μg/μl的标准溶液备用。
       2.3.2 色谱条件选择仪器：Agilent 1100 Series
       分析条件：Microsorb-MV100 C18 (5 μm，4.6 mm×250 mm )。无水甲醇为流动相，进样量20 μl，流速0.5 ml/min，检测波长203 nm, 柱温为室温。样品中薯蓣皂苷元与其它成分达到良好分离(见图1～2)。样品含量测定：以上述色谱条件对盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元含量进行分析，并计算其含量。
       2.3.3 样品含量测定以上述色谱条件对盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元含量进行分析，并计算其含量。
       2.4 盾叶薯蓣部分辐射诱变株系一年生苗薯蓣皂苷元含量分析将辐射诱变株系试管苗在其试管苗在MS/2+IAA0.2 mg/L+ NAA0.2 mg/L培养基上诱导生根，待根长至3～4 cm左右将试管苗移出培养室。在室温下开瓶加入少量水保湿，炼苗1～2 d。将试管苗取出，小心洗去苗上的培养基。傍晚时分，将苗栽入以蛭石和复合肥为基质的苗床中，每日中午喷雾2 h保湿，30 d后移栽到大田中，使其在自然条件下生长1年，挖取地下根茎, 去除泥沙、切片、在60℃干燥至恒重，粉碎过60目筛, 供含量分析用。由于盾叶薯蓣试管苗移栽成活率较低，导致一年生辐射诱变各株系材料有限，因此我们仅对5个株系进行了薯蓣皂苷元含量进行了分析。测定方法除样品量为0.2～0.3 g外，其他同“2.3”。图1 薯蓣皂苷元对照品的RP-HPLC图谱 1为薯蓣皂苷元峰图2 盾叶薯蓣样品的RP-HPLC图谱 1为薯蓣皂苷元峰
       3 结果
       3.1 不同辐射剂量丛生芽的存活率由表1知剂量为200，100 Gray时存活率几乎为零，而剂量为50 Gray时基本为半数致死量，辐照效果最佳。对存活幼苗进行编号，建立株系，并进行扩大繁殖。繁殖过程中淘汰长势较差、生长畸形的株系，经淘汰，最终保留Co72，Co27，Co6，Co25，Co86，Co61，Co24，Co68， Co32， Co12， Co76等11个生长健壮的株系作为进一步选育的材料。表1 不同辐射剂量丛生芽的存活率
       3.2 辐射诱变株系SOD，POD，APX活性测定由表2可以看出，盾叶薯蓣辐射诱变株系APX活性、POD活力和SOD活力与对照相比均没有明显的规律性，其中6个株系的APX活性比对照高，其余株系均比对照低;6个株系的POD活性高于对照株系，平均高出20.0 %。8个株系的SOD活性高于对照，活性最高的株系Co76比对照高出161 %，以上结果表明，经过辐照，植物体内会产生不同的应激反应来抵御外界的刺激，引起酶活力的增强或减弱，由于辐照带有很大的随机性，在酶活方面，并没有很强的规律性。
       3.3 盾叶薯蓣辐射诱变株系试管苗薯蓣皂苷元含量分析对诱变获得的11个株系试管苗的薯蓣皂苷元含量进行了初步分析，结果见表3，部分株系的高效液相色谱图见图3～5。测定结果显示：11个辐射诱变株系中，有6个株系的薯蓣皂苷元含量高于对照，平均比对照株系高出25.0%。其中Co27、Co24、Co86、Co68 、Co25、Co12分别比对照株系高出67 %，33 %，25 %，25 %，17 %，17 %。3.4 盾叶薯蓣辐射诱变株系一年生苗薯蓣皂苷元含量分析表4结果表明，辐射株系试管苗与一年生苗薯蓣皂苷元含量的相关性不明显。表2 盾叶薯蓣辐射诱变株系和对照株系试管苗SOD，POD，APX活性表3 盾叶薯蓣辐射诱变株系薯蓣皂苷元含量表4 试管苗与一年生苗薯蓣皂苷元含量
       4 讨论
       SOD在需氧原核生物和真核生物中广泛存在，是活性氧清除系统中第一个发挥作用的抗氧化酶，也是植物体内氧代谢的关键酶，在保护细胞免受氧化损伤过程中具有十分重要的作用。POD可清除植物体内的H2O2，从而使需氧生物体免受H2O2的毒害，APX被认为叶绿体中清除H2O2的关键酶[4]。试验获得的大部分盾叶薯蓣辐射诱变株系SOD，POD和APX比活力均高于二倍体，说明这些株系将具有比对照株系更高的抗逆性或抵抗自然灾害的能力。这为植物抗逆性的提高和产量的增加提供一条有效途径;极大的缩短了选育时间，为优良品种的前期筛选提供了新的研究思路;为应用组织培养技术进行优良品种选育提供了新的研究方法。
       成分分析结果说明大部分辐射诱变株系薯蓣皂苷元含量超过了对照株系，说明辐射诱导可以作为盾叶薯蓣优良品种选育的途径，所得株系为进一步选育优良品种提供了有用的育种材料。
       在试管苗阶段薯蓣皂苷元含量差异明显的株系生长一年后，含量差异并不明显，这可能与辐射所引起的变异具有很大的随机性，遗传不稳定有关，但整体来讲，在试管苗阶段薯蓣皂苷元含量高的株系在苗床生长一年后，薯蓣皂苷元含量一般也较高。
       【参考文献】
         　[1] 张志良，翟伟蕾.植物生理学实验指导[M]. 北京：高等教育出版社, 2006：168.
       
       [2] 王俊，杨克迪，陈钧. 均匀设计法优选穿山龙的水解工艺条件[J]. 中药材，2002，9：659.
       
       [3] 谢彩侠，高山林，朱丹妮，等.盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元不同提取方法的比较[J]，植物资源与环境学报，2005，14(1)：23.
       
       [4] 於丙军，刘友良. 盐胁迫对一年生盐生野大豆幼苗活性氢代谢的影晌[J]. 西北植物学报，2003，23(1)：18.