三越麻黄汤有效部分的确定及其理化性质研究
作者：滕 亮，马桂芝，李 军，孙殿甲
作者单位：(新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011)
《时珍国医国药》 2010年 第11期
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【摘要】
目的分离筛选出三越麻黄汤有效部分并对其理化性质进行初步研究。方法采用系统溶剂法分离标准汤剂的各极性部分，以各极性部分对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响及小鼠气管酚红排泌量的影响为指标对各极性部分的药理效应进行考察并确定有效部分。在此基础上对有效部分的理化性质(吸湿性、溶解度、休止角、松密度)进行初步考察。结果确定正丁醇部分为有效部分。有效部分的临界相对湿度为51%，在正丁醇中溶解度最大，休止角为50.2°，堆密度为0.41g/ml。结论采用系统溶剂法分离、筛选有效部分是可行的。理化性质研究研究表明有效部分的吸湿性较强，水溶性、流动性较差。
【关键词】 三越麻黄汤; 有效部分; 理化性质; 研究
三越麻黄汤源自古方及临床实践的结合(由麻黄、石膏、苦杏仁、板蓝根、甘草、陈皮、柴胡、射干、鱼腥草、浙贝母等组成)，主用于治疗外感风寒引起的感冒及急性支气管炎、支气管肺炎、支气管哮喘症等。我们在优选出其最优提取工艺后[1]，根据有效部分的概念采用极性梯度分离的方法并结合主要药效学指标初步确定了其有效部分，并对其理化性质进行了初步研究，以期为该复方的深入研究奠定实验基础，同时为中药复方有效部分的研究提供借鉴。
1 仪器与材料
1.1 仪器721可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)，电子分析天平(BS110S，北京赛多利斯有限公司，d:0.1mg)，BT—1000粉体综合特性测试仪(丹东百特仪器有限公司)。
1.2 试药麻黄、甘草、射干、陈皮、柴胡、鱼腥草、石膏、浙贝母、苦杏仁、板蓝根(均符合《中国药典》2005版要求)。氯仿、醋酸乙酯、正丁醇、伊文思蓝、酚红均为分析纯，乙醇为工业级。
1.3 动物昆明种小鼠，清洁级，购自新疆医科大学动物实验中心，合格证号：新医动字(96)16001号。
2 方法与结果
2.1 标准提取液的制备按处方比例称取10 kg药材(最粗粉)，将柴胡、浙贝母、甘草、陈皮、鱼腥草、射干6味药材，以80%乙醇为溶媒，回流提取3次，所加溶媒量为药材量的8倍，回流提取时间为1.5 h/次，合并乙醇提取液，减压(-0.07～-0.08MPa、温度60～70℃)回收乙醇至无醇味，另器存放。以水为溶媒，将醇提药渣与剩余4味药材(麻黄、生石膏、苦杏仁、板蓝根)进行合煎，共煎煮2次，2.5 h/次，每次加水量为药材量的16倍，合并水提液，减压浓缩(-0.07～ -0.08 MPa、温度90℃)，将此浓缩液与回收乙醇后的浓缩液合并，继续浓缩，并减压干燥(-0.07 ～ -0.08 MPa、温度60～70℃)至干浸膏，得干浸膏约2.3 kg。
2.2 不同极性部分的分离[2～4]取干浸膏1 540 g(约相当于药材6 623 g)分次用索氏提取器进行回流提取。具体操作方法为：首先用醋酸乙酯进行提取，当提取液无色时即认为提取完全，则将提取剩余浸膏干燥至无醋酸乙酯味，然后用氯仿进行回流提取至提取液无色，将剩余浸膏干燥至无氯仿味，然后装入渗漉筒内，以正丁醇为渗漉溶媒进行渗漉至渗漉液无色。分别将醋酸乙酯提取液、氯仿提取液、正丁醇渗漉液减压回收有机溶剂，并分别减压浓缩至稠浸膏，将稠浸膏分别进行减压冷冻干燥至干浸膏，密闭保存，分别记为醋酸乙酯部分、氯仿部分、正丁醇部分。将正丁醇渗漉后剩余浸膏干燥至无正丁醇味，因该部分既具有水溶性的高极性成分，又具有水中所不溶的化合物，故记为水溶及水不溶物部分。结果见表1。表1 极性部分的分离结果
2.3 有效部分的筛选
2.3.1 样品的制备分别取适量各不同极性分位样品置于研钵中，加少量乙醇润湿后加0.5%羧甲基纤维素钠溶液，边加边研磨至溶液为均匀混悬液，分别得醋酸乙酯部分样品、氯仿部分样品、正丁醇部分样品、水溶及不溶物部分样品。
2.3.2 有效部分的筛选
各极性部分对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响[2，5，6]：取昆明种小鼠60只，雌雄各半，体质量(19.5±1.4)g，随机分为生理盐水组、标准汤剂组、醋酸乙酯组、氯仿组、正丁醇组、水溶及不溶物组，ig给药，1次/d，连续3 d，于末次给药后1.5 h尾静脉注入0.5%的伊文思蓝生理盐水溶液0.1 ml/10 g并立即ip0.6%的乙酸0.2ml/只，20 min后处死小鼠，剪开腹部，用6 ml 生理盐水分次洗涤腹腔，吸出冲洗液，合并后以生理盐水稀释至10 ml，3 000 r/min离心15 min，取上清液于590 nm处测吸收度值，并以抑制率(%)=[(对照组吸光度—实验组吸光度)/ 对照组吸光度×100%]计算抑制率，采用PEMS3.0统计程序对表中数据进行统计学处理。结果见表2。表2 极性部分对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响各极性部分对小鼠气管酚红排泌量的影响[2，7～9]：取健康昆明种小鼠60只，体质量(21.0±1.6)g，随机分为生理盐水组、标准汤剂组、醋酸乙酯组、氯仿组、正丁醇组、水溶及不溶物组，ig给药，1次/d，连续3 d，第2天晚禁食不禁水。于末次给药后30 min，按0.1 ml/10 g ip5%酚红生理盐水溶液，注射后30 min处死小鼠，剥离气管周围组织，剪下自甲状软骨下至气管分支处的一段气管，放入盛有2 ml生理盐水的试管中，再加0.1 ml的1mol/L的氢氧化钠溶液，在546 nm处测吸收值，与酚红标准曲线比较，折算出酚红量(μg/ml)，采用PEMS3.0统计程序对表中数据进行统计学处理。结果见表3。表3 极性部分对小鼠气管酚红排泌量的影响 综合上述主要药效学筛选结果可认为正丁醇组为三越麻黄汤有效部分。将正丁醇部分浸膏低温粉碎后过40目筛待用。
2.4 有效部分的理化性质研究
2.4.1 吸湿性研究[10，11]称取有效部分浸膏粉约1g，精密称重，放入已恒重的称量瓶中，减压干燥至恒重，精密称重后置于不同相对湿度条件下，定时取样，称重，测定吸水量，以下式计算吸湿百分率。吸湿百分率(%)=吸湿后颗粒重量-吸湿前颗粒重量吸湿前颗粒重量×100%以吸湿百分率对时间及相对湿度作图。见图1。图1 吸湿百分率-时间-相对湿度三维图 以第7天吸湿百分率对相对湿度作图。见图2。由图2可见有效部分浸膏粉的临界相对湿度(CRH)为51%。
2.4.2 溶解度测定[12]称取有效部分浸膏粉的适量，置于(25±2)℃一定量的溶剂中，每隔5 min强力振摇30 s，观察30 min内的溶解情况，如看不见溶质颗粒时，则视为完全溶解。结果见表4。图2 吸湿百分率—相对湿度曲线图表4 溶解度测定结果
2.4.3 休止角的测定[11]采用BT-1000粉体综合特性测试仪测定有效部分浸膏粉的休止角。当试样落满试样台并呈对称圆锥体后停止加料，关闭振动筛电源，将测角器置于试样托盘左侧并靠近料堆，与圆锥料堆斜面平齐，测定休止角α。重复上述操作5次。结果见表5。经计算该有效部分浸膏粉的休止角为50.6°。表5 休止角测定结果
2.4.4 振实密度测定[11]采用BT-1000粉体综合特性测试仪测定有效部分浸膏粉的振实密度。将适量有效部分浸膏粉小心装入测试套筒中，关闭振动筛，打开振动电机开关，连续振动，直至粉体表面不再下降后停止振动，计算有效部分浸膏粉松密度ρb。重复上述操作5次。结果见表6。经计算有效部分浸膏粉的松密度为0.40 g/ml。表6 松密度测定结果
3 讨论
3.1 关于极性部位的分离中药复方有效部分的概念不同于有效部位。罗国安等[13]提出有效部分的概念，认为有效部分是指中药复方中具有相近化学性质的一大类化合物(药效成分群)。对于这一目标成分的分离有以下几种思路：①以全方制剂为整体, 植物化学系统分离鉴定和筛选。方法一为余亚纲[14]提出中成药系统分析三元论设计，即按极性、分子量大小和酸碱性强弱的三元结构对中药复方进行分离鉴定和筛选。方法二为中药复方多模式多系统统一色谱分离鉴定法。结合联用技术，姚新生等[15]亦提出了类似的分离方法。②以各单味药有效部分研究为主体，通过不同模型的药效筛选，综合比较分析各部位间及与全方制剂作用的方法。③结合中医理论和配伍原则，检测复方组分在制剂、胃肠道和体内化学变化及影响的方法。通过文献调研[16～19]我们认为三越麻黄汤药味较多，可采用黑箱理论，将该复方视为一个整体进行研究，不仅可观且可避免许多繁琐的分析(如不必分析该方在提取过程中是否有新的化合物生成)，从而简化了研究思路，因此在确定该方的提取工艺后将其标准汤剂视为研究主体。在极性分离方面文献建议对传统汤剂采用萃取的方法进行极性分离，但我们在预实验中发现萃取过程中很容易发生乳化现象，乳化层难以除去，给分离带来较大困难。而将标准汤剂减压浓缩干燥后采用回流法则可避免以上现象，使分离得以顺利进行。
3.2 关于有效部分筛选指标的确定三越麻黄汤具有辛凉解表、清热解毒、宣肺止咳、化痰利咽之功效。主治四时外感、肺热咳喘证。该方是在中医经典著作《伤寒论》“麻杏石甘汤”的基础上，结合新疆大陆性气候特点，加入柴胡、射干、鱼腥草、浙贝母等辛凉透表、清热解毒、化痰利咽药物而成的经验方剂。通过大量临床实践证实，处方配伍严谨，组成独特，属辛凉泄卫与辛寒清气并施之剂，适用于四时外感，肺热咳喘的卫气病证，对于邪在卫气阶段的呼吸系统疾病有较好的治疗作用，适用于现代医学的病毒性感冒、流行性感冒、上呼吸道感染、急慢性支气管炎、大叶性肺炎、喘息型肺炎、百日咳、小儿肺炎、麻疹合并肺炎、非典型肺炎等疾病而见风热在表、邪热壅肺、肺失宣降之证者，临床应用中可显著抑制肺间质渗出液的增加并有较显著的祛痰功能。同时用于筛选的药效指标要符合客观、可量化、准确、重现性好且与中医证的特点接近等要求，因此我们确定采用对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响及小鼠气管酚红排泌量的影响为有效部分筛选的指标。
3.3 关于有效部分的确定在以对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响为指标的筛选实验中我们初步确定了有效成分组为正丁醇组、醋酸乙酯组，且可认为药效强弱顺序为正丁醇组>醋酸乙酯组。在以对小鼠气管酚红排泌量的影响为指标的筛选实验中我们初步确定了有效成分组为正丁醇组、水溶及不溶物组，且可认为药效强弱顺序为正丁醇组>水溶及不溶物组。综合以上筛选试验的结果及出膏率的结果我们认为正丁醇组为有效部分，结果也提示采用系统溶剂法分离中药复方的有效部分是可行的。
3.4 关于有效部分的理化性质研究处方前研究表明该有效部分提取物在一定湿度条件下放置7 d即接近吸湿平衡，其临界相对湿度为51%，提示该提取物的吸湿性较强，其生产环境及储存条件的相对湿度不宜高于51%，否则会因吸潮而影响有效部分质量，而在制剂研究中则需注意其稳定性的研究，需采取适当措施以提高制剂的湿稳定性。溶解度实验表明该有效部分提取物在正丁醇中溶解度最大，为略溶，此溶解度测定结果可能与其化合物组成及分离过程有关，由于采用极性分离，正丁醇部分所含成分多为苷类、有机酸、碱类化合物，反之，这些化合物的的混合物在正丁醇中的溶解度较大，在水中也有一定的溶解，表明该极性部分的极性居中，既有一定亲水性，又有一定亲油性。粉体学研究表明该原料的休止角为50.6°，这可能与粒子间存在的较强吸附力及有效部分本身的较强吸湿性有关，同时也与干燥后浸膏状态有关，说明其流动性较差，会影响制剂中的相关操作;该提取物的振实密度为0.40 g/ml，这与干燥工艺有关，经过减压真空干燥后，物料中的溶剂被减压抽出而使物料起泡，使得物料极为松散，同时也说明粒子间隙较大，该数据也为容量法分装有效部分提供了依据。
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