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       【摘要】 
       目的研究舒肝健脾补肾中药对慢性应激肝郁模型孕鼠血清P、IGF-1、IGF-2、子宫蜕膜PR水平及胎鼠、胎盘重量的影响，探讨肝郁影响生殖功能的机理及舒肝健脾补肾中药的作用机理。方法复制孕鼠慢性应激肝郁模型，将60只孕鼠随机分为5组：正常组、模型组、舒肝健脾补肾高组、舒肝健脾补肾低组、滋肾育胎丸组。孕19 d剖宫取胎，放射免疫法测定孕鼠血清P、IGF-1、IGF-2的含量，用免疫组化法检测子宫蜕膜PR水平。结果模型组孕鼠血清P、IGF-1、IGF-2、子宫蜕膜PR水平及胎鼠、胎盘重量较正常组明显降低(P﹤0.01)。舒肝健脾补肾高组血清P、IGF-1、IGF-2、子宫蜕膜PR水平及胎鼠、胎盘重量明显高于模型组(P﹤0.01)。舒肝健脾补肾低组与与模型组相比无明显差异(P﹥0.05)。结论舒肝健脾补肾方能提高慢性应激肝郁模型胎鼠、胎盘的重量。能提高孕鼠血清IGF-1、IGF-2的水平、P水平、子宫蜕膜PR水平。研究结果为临床运用舒肝健脾补肾法治疗肝郁型胎儿宫内发育迟缓提供了理论依据。
       【关键词】  肝郁模型; 舒肝健脾补肾方; 胎儿宫内发育迟缓
       胎儿宫内发育迟缓是指胎儿出生体重低于同孕龄胎儿平均体重的两个标准差或第10百分位数，是围产儿发病和死亡的主要危险因素之一,还可影响儿童期和青年期发育，影响人口素质[1]。胎儿宫内发育迟缓应属于祖国医学的“胎萎不长”“胎不长”“妊娠胎萎燥”。中医学认为，肝主疏泄，调畅情志。情志不遂，疏泄失职，致肝气郁结，而肝气郁结可致气滞、血淤、痰湿，可影响脾肾功能，导致肝脾肾同病，胎失所养，胎萎不长。
       本研究通过建立妊娠大鼠慢性应激肝郁动物模型，并以舒肝健脾补肾方药进行干预。实验过程中，观察孕鼠的自主行为，测定P、IGF-1、IGF-2、子宫蜕膜PR水平、胎鼠体重、胎盘重量，从中医肝郁角度探讨胎儿宫内发育迟缓的机理，研究舒肝健脾补肾中药对慢性应激肝郁状态下妊娠大鼠及胎儿宫内发育的影响，从而揭示肝郁影响生殖功能的机理及舒肝健脾补肾中药的作用机理。
       1 材料与仪器
       1.1 实验动物分组Wistar雌性大鼠60只，体质量(240±30)g(购自河南省实验动物中心)。按2∶1比例雌雄鼠合笼。每天进行阴道脱落细胞涂片，直到见到大量云片状上皮细胞中夹有大量精子作为妊娠第1天。将孕鼠随机分为5组：即正常对照组(简称正常组)、模型对照组(简称模型组)、舒肝健脾补肾高剂量组(简称舒肝健脾补肾高组)和舒肝健脾补肾低剂量组(简称舒肝健脾补肾低组)、滋肾育胎丸组(简称阳性药组)，每组12只。
       1.2 药材按原方剂量40倍取材制剂。舒肝健脾补肾方：柴胡360 g，制香附360 g，生白芍600 g，苏梗360 g，黄芩360 g，党参600 g，炒白术600 g，熟地1200g，杞子600 g，生山药1 200 g，菟丝子1200g，川断480 g，寄生480 g。滋肾育胎丸：购自广州中一药业有限公司。国药准字Z44120018，批号：070806。所得制剂浓度分别相当于生药含量的3.82，0.242 g/ml，由河南省中医药研究院制剂室提供。批号：20070810。
       1.3 试剂及器材P、IGF-1放免试剂盒(购自天津九鼎医学生物工程有限公司)。IGF-2放免试剂盒(购自解放军总医院科技开发中心放免研究所提供)。敞箱(自制)：高为50 cm，长宽均为80 cm,周壁为黑色，底面用白线划分为面积相等的25块。束缚筒(自制)：束缚筒直径为6 cm，长为16 cm。制动箱(自制)：长为40 cm，宽为30 cm，高为30 cm。程控穿梭箱：DCS-2，医科院药研所制。电子秤：EB-2800M，LIBROR。离心沉淀机：LXJ-II，上海医用分析仪器厂。石蜡切片机：Leit2，德国。摊片烤片机：HG3003-3，南京电器三厂制造。微波炉：格兰仕，800W。光学显微镜：GALEN-II3696，BAUSCH LOMB。双目显微镜(自动照相)：BHA，日本。全自动γ-放射免疫计数器：FJ-20089，南京。
       2 方法
       2.1 动物模型的建立 按文献法[2～5]，对模型组及药物干预组孕鼠进行慢性心理应激实验。孕鼠接受的应激包括：(1)束缚筒束缚，2h/次，3次/d。(2)程控穿梭箱声-电刺激，刺激参数为①声：强度为65 dB，每循环持续60 s，3循环/次，9循环/d;②电：足底电击电流强度为3 mA，每循环持续65 s，3循环/次，9循环/d。连续刺激至动物处死，应激实验环境与饲养环境分开，正常组孕鼠不给予刺激，孕鼠受刺激后出现尖叫、直立、挠腮、撕咬、蜷缩、饮食减少、大便稀薄、体重下降，提示肝郁模型建立。
       2.2 给药剂量与方法正常组给予蒸馏水灌胃，10 ml/kg，1次/d,连续18 d。模型组造模后给予蒸馏水灌胃，10 ml/kg，1次/d，连续18 d。舒肝健脾补肾高剂量组造模后给予舒肝健脾补肾方浸膏稀释液灌胃，13.12 g/ kg·d，相当于成人剂量的13.4倍，10 ml/kg，1次/d，连续18天。舒肝健脾补肾低剂量组造模后给与舒肝健脾补肾方浸膏稀释液灌胃，6.56 g/k g·d，相当于成人剂量的6.7倍，10 ml/kg，1次/d，连续18d。滋肾育胎丸组：造模后常规饲养,给予滋肾育胎丸稀释液灌胃，2.42 g/ kg·d，相当于成人剂量的13.4倍，10 ml/kg，1次/d，连续18 d。
       2.3 检测指标及方法
       2.3.1 一般状态及自主活动的观察 分组后，开始仔细观察和记录各组孕鼠体重及自主活动情况，并作出造模前后孕鼠的体重及自主活动情况变化对比。在心理应激刺激前后，分别进行开放场地实验(敞箱试验，Open-field test，OFT):将受试大鼠放在OFT中心区域，同时开始记录3min内孕鼠穿越格数(以三足踏入同一格为准)，以及孕鼠直立(双前肢离地)次数[6～8]。每只动物仅进行1次测定，3min/次。
       2.3.2 阴道上皮脱落细胞的观察大鼠合笼后，每天早上8点进行阴道上皮脱落细胞的观察。将沾有生理盐水的棉签轻柔旋人母鼠的阴道(0.5 cm)，旋转一圈以后拿出,再将棉签上沾有的阴道内分泌物涂于清洁的玻片上。稍干，用95%水乙醇固定3～5 min，HE染色，风干。在200×普通光学显微镜下观察，1次/d，直到见到大量云片状上皮细胞中夹有大量精子作为妊娠第1天。
       2.3.3 血清的测定在妊娠第19天时断头处死孕鼠,取血4～5 ml，静置分层、离心、分离血清，将分离血清储存于-70℃冰箱内。用放射免疫分析法测定P、IGF-1、IGF-2，由河南省中医药研究院放免室检测，按试剂盒说明书操作。
       2.3.4 子宫蜕膜PR水平的检测将4%多聚甲醛液固定的子宫，常规脱水，浸蜡、包埋，切片厚度5 μm。由河南省肿瘤医院病理实验室检测，严格按照PR免疫组化试剂盒说明书操作。免疫组化法判断标准：每张切片在 200 ×光镜下观察 5 个视野，阳性染色为细胞核或细胞浆内出现棕黄色颗粒。阳性细胞表达占 10～30%为 “+ ”，占50%以上为“+++”，在两者之间为“++”;阴性表达：未见阳性或阳性细胞占5%以下，表达为“-”。
       2.3.5 胎鼠、胎盘重量在妊娠第19天时断头处死孕鼠，解剖取出胎鼠、子宫、胎盘进行称重。
       2.4 统计学处理所有数据均采用SPSS 13.0软件进行统计处理，计量资料结果以±s描述;符合正态分布计量资料多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用q检验，不符合正态分布的采用对数法或倒数法进行转换为正态资料后进行统计分析，多个独立样本非参数检验用等级频数资料分析。
       3 结果
       3.1 舒肝健脾补肾方对慢性应激肝郁模型孕鼠自主活动的影响结果见表1。表1 各组孕鼠敞箱试验中穿越格数及直立次数的影响结果显示造模前各组孕鼠穿越格数经F检验得，F=0.668，P=0.617>0.05，提示造模前各组差别均无意义，具有可比性。造模后舒肝健脾补肾高、低组及阳性药组孕鼠穿越格数显著低于模型组(P<0.01)。正常组孕鼠穿越格数显著低于模型组(P<0.05)。造模前各组孕鼠直立次数经F检验得，F=0.884，P=0.481>0.05，提示造模前各组差别均无意义，具有可比性。造模后正常组、舒肝健脾补肾低组孕鼠直立次数低于模型组(P<0.05);舒肝健脾补肾高组及阳性药组孕鼠直立次数低于模型组(P<0.01)。
       3.2 舒肝健脾补肾方对慢性应激肝郁模型孕鼠血清IGF-1、IGF-2水平的影响结果见表2～3。
       3.3 舒肝健脾补肾方对慢性应激肝郁模型胎鼠体重、胎盘重量的影响结果见表4。结果显示模型组孕鼠血清IGF-1、IGF-2较正常组明显降低(P﹤0.01)。舒肝健脾补肾高组及阳性药组血清IGF-1、IGF-2明显高于模型组(P﹤0.05)。舒肝健脾补肾低组与模型组相比无明显差异(P﹥0.05)。表2 舒肝健脾补肾方对孕鼠血清IGF-1的影响表3 舒肝健脾补肾方对孕鼠血清IGF-2的影响表4 各组胎鼠的体重、胎盘重量比较结果显示模型组胎鼠体重、胎盘重量显著低于正常组(P<0.01);舒肝健脾补肾高组及阳性药组胎鼠体重、胎盘重量重量显著高于模型组(P<0.01);舒肝健脾补肾低组胎鼠体重、胎盘重量与模型组相比无明显差异(P>0.05)。
       3.4 舒肝健脾补肾方对慢性应激肝郁模型孕鼠血清P水平的影响结果见表5。表5 舒肝健脾补肾方对孕鼠血清P水平的影响结果显示模型组孕鼠血清P水平显著低于正常组(P<0.05);舒肝健脾补肾高组孕鼠血清P水平显著高于模型组(P<0.01);阳性药组孕鼠血清P水平高于模型组(P<0.05)，舒肝健脾补肾高组优于阳性药组，舒肝健脾补肾低组血清P水平显著高于模型组(P<0.05)。
       3.5 舒肝健脾补肾方对慢性应激肝郁模型孕鼠子宫蜕膜的PR水平的影响结果见表6。表6 舒肝健脾补肾方对孕鼠子宫蜕膜的PR水平的影响结果显示模型组孕鼠子宫蜕膜的PR水平显著低于正常组(P<0.01);舒肝健脾补肾高组孕鼠子宫蜕膜的PR水平显著高于模型组(P<0.01);阳性药组孕鼠子宫蜕膜的PR水平显著高于模型组(P<0.05)。
       4 讨论
       妊娠期间阴血不足，气易偏盛的特点，正常妊娠就易导致阴亏、气滞、痰饮的产生，而肝郁更易加重气滞，导致疾病的产生。正常的妊娠需要气血的滋养及脾肾的固摄，肝郁可致气滞血淤，气血运行受阻;肝郁可横逆犯脾，影响脾的生化功能使气血生化不足，影响脾的运化功能，使水湿、痰饮病理产物产生，气血运行受阻，此外还可影响到脾的升清固摄功能，使气血不能正常的运行;肝郁可导致肾的封藏功能失常，冲任不固;肝郁日久，耗血伤精，肝肾精血不足，冲任不充，若肝郁化火，热伤冲任，暗耗阴血。因此肝郁可引起脾肾功能异常，导致肝脾肾同病，胎失所养，引起胎萎不长、胎动不安、胎漏。治疗肝郁导致宫内发育迟缓时，运用疏肝药时要注意妊娠“阴血不足，阳气偏亢”的特点，疏肝理气药用量不易过重，不宜用过多香燥理气之品，以免暗耗阴血，遵循“养其血，舒其郁，顺其性，柔其体，以柔为法”的法则，要疏肝柔肝和胃、理气安胎 。但不能单用疏肝药，同时要考虑到妊娠病的特点、与脾肾的关系以及肝郁影响脾肾功能的特点，疏肝的同时要健脾补肾安胎、养胎，健脾补肾安胎药用量易大，药味易多，达到理气不伤正，滋阴不滋腻，使冲任充足固护，胎孕正常。这正是舒肝健脾补肾方组方原则。
       胎鼠、胎盘的重量反映了胎鼠在宫内发育的情况，实验表明慢性应激肝郁状态下胎鼠、胎盘的重量下降，从而造成IUGR。舒肝健脾补肾方能使慢性应激肝郁模型胎鼠、胎盘的重量增加，这反映了该方能改善胎鼠在宫内发育的环境，促进胎鼠全身各器官的发育，从而使胎鼠、胎盘的重量增加。IGF-1、 IGF-2是胎儿生长的重要调节因子，是维持胎儿生长是必需的因子。IGF-1主要是促进胎儿器官成熟，IGF-2主要调节胎儿、胎盘的生长发育。孕妇血清中的IGF-1、 IGF-2不经过胎盘屏障，但可通过调节营养物质经胎盘供给胎儿，增加胎儿的分泌及生物利用度，从而促进胎儿的正常发育[9]。研究已证实，无论胎儿 IUGR是由宫内营养不良或缺氧或胎盘功能异常所致，均首先通过降低IGF-1、 IGF-2，从而使各型细胞分裂、分化、增殖、成熟或存活的能力以及组织器官对葡萄糖摄取和氧化及对氨基酸摄取的能力降低 ,细胞分裂周期延长、数量减少、功能障碍 ,最终导致其生长发育迟缓[10]。实验结果表明舒肝健脾补肾方能提高慢性应激肝郁模型孕鼠血清IGF-1、IGF-2水平，从而促进胎鼠的正常发育。P对受精卵的种植和妊娠的维持有非常重要的作用，实验证明舒肝健脾补肾方能提高慢性应激肝郁模型孕鼠血清P的含量。而P作用的强弱取决于激素水平和靶细胞激素受体的含量、特异性及亲和力[11]。PR水平的降低使P缺少有效的靶点难以发挥激素样作用导致胎儿不能正常发育。实验表明舒肝健脾补肾方通过显著增加孕鼠子宫蜕膜的PR的含量，并增强其对孕激素的敏感性，使得孕激素与孕激素受体相结合，充分发挥孕激素的生物效应，从而实现对性腺轴的激素-激素受体的调节。动物的情绪改变可以通过观察大鼠的行为来间接感知，敞箱试验是最常用于测定大鼠情绪、心理状态的行为学实验方法，能以量化的指标客观反映大鼠的焦虑程度以及对外界、未知的探究欲望，从而提示受试大鼠的情绪、心理状态。本实验证实：慢性应激刺激孕鼠处于心理应激状态，并表现出情绪烦躁不安和焦虑状态。舒肝健脾补肾方能调节孕鼠的情绪，减轻不安和焦虑。同时也证实心理应激反应以及对机体产生的影响与肝的疏泄功能存在关联。结合本实验结果，可以初步推断舒肝健脾补肾方通过影响中枢神经系统的生理活动，减轻心理应激对孕鼠情绪的影响。
       综上所述，本实验从多方面证明了舒肝健脾补肾方能改善宫内环境，能显著增加血清中的 IGF - I 、IGF-2水平。能显著提高血清P的含量，子宫蜕膜的PR水平，增强P的生物效应。还能增加胎鼠、胎盘的重量。可见，舒肝健脾补肾方对于胎儿宫内发育有调节作用，这对临床运用舒肝健脾补肾法治疗肝郁型胎儿宫内发育迟缓提供了客观依据。
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