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       【摘要】 
       目的建立红毛五加皮多糖的含量测定方法，对不同产地样品进行测定。方法采用苯酚-硫酸比色法。结果葡萄糖的线性范围为24.05～54.11 μg /ml，平均加样回收率为97.80 %，RSD为1.59%（n=6）。红毛五加皮的多糖含量为6.83%～24.50%；木心的多糖含量为5.78%～9.21% 。结论该方法快速、准确，可为红毛五加药材的质量控制提供参考。建议红毛五加皮多糖含量不得低于10.9%，木心具有一定利用价值。
       【关键词】  红毛五加皮　多糖　苯酚-硫酸比色法
       Determination of Polysaccharides in Cortex acanthopanacis giraldii by Phenol-sulfuric acid Colorimetry
       ZHONG Shihong，WEI Yingfang，GU Rui，HUANG Xiaoxue，XIE Wuchao，YANG Xiang
       1. Pharmacological School，Chengdu Medical College, Chengdu 610081，China；2. Chengdu University of TCM，Chengdu 611131，China
       Abstract：ObjectiveTo determine the content of polysaccharides in cortex acanthopanacis giraldii from different regions.MethodsPhenol-sulfuric acid colorimetry was used to determine the content of polysaccharides. ResultsThe linear range of glucose was 24.05～54.11 μg / ml. The average recovery was 97.80%,and RSD was 1.59%（n=6）. The polysaccharides content of bark was within the range of 6.83%～24.50% and that of xylem was within the range of 5.78%～9.21%.ConclusionThe method is rapid,accurate and can be used for the quantity control of A. Giraldii Harms. The polysaccharides content of bark should not be lower than 10.9%. The xylem is valuable in some degree.
       Key words： Cortex acanthopanacis giraldii; Polysaccharides; Phenol-sulfuric acid colorimetry
        红毛五加皮为四川地区的习用药材和岷江上游羌民族特色药材，收载于《四川省中药材标准》1987年版，具有祛风湿、强筋骨、利关节之功效。作为红毛五加中的一类主要有效成分，红毛五加多糖（AGP）已被广泛证实具有提高免疫［1］、抗肿瘤［2］、抗病毒［3］等药理活性。因此，多糖含量是评价红毛五加皮质量的重要指标。本研究建立了以苯酚-硫酸比色法测定红毛五加皮中多糖的方法，并对不同产地样品进行了含量测定，以期为该药材的质量控制提供科学依据。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器UV1102紫外/可见分光光度计（上海天美），电子天平（Sartorius BS224S 北京）。
       1.2  试药试剂D-葡萄糖对照品（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）。4%苯酚为182℃馏分加蒸馏水配制而成，乙醇、丙酮等试剂均为分析纯。水为蒸馏水。
       1.3  样品自采或购买，经成都中医药大学卫莹芳教授鉴定为红毛五加Acanthopanax giraldii Harms的干燥茎皮及木心。样品均粉碎为中粉。
       2  方法与结果
       2.1  红毛五加多糖的提取与精制称取红毛五加茎皮粉末60 g，置索氏提取器中，依次用石油醚（60～90℃）、乙醚、80％乙醇回流提取至无色（各约8 h）。残渣挥干乙醇，每次加水800 ml回流提取1 h，共提取4次，趁热过滤，合并滤液，减压浓缩至约200   ml。加95％乙醇使含醇量为80％，搅匀，冰箱中静置过夜，抽滤得粗多糖。加水配成1％粗多糖溶液，Sevage法脱蛋白［4］。加入30％H2O2脱色［5］。所得溶液减压浓缩至约200 ml，加入95％乙醇使溶液含醇量为80％，搅匀，冰箱中静置过夜，抽滤得下层多糖。以无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤多糖，60 ℃真空干燥，得黄白色的红毛五加精多糖粉末。
       2.2  供试品溶液制备方法考察称取红毛五加茎皮粉末约1.0 g，共4份，精密称定，置索氏提取器中，加入80%乙醇回流提取至无色。残渣挥干乙醇，每次加水适量回流提取30 min，其中2份提取3次，另2份提取4次，抽滤，合并滤液置500 ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。分别精密吸取各供试品溶液0.8 ml，各加入1.2 ml蒸馏水、4％苯酚溶液1.0 ml，摇匀，加入浓硫酸5.0 ml，40 ℃水浴加热15 min，置冰水中冷却5 min，于487 nm测定吸光度。结果无明显差异。
       
       遂确定供试品溶液的制备方法为：精密称取样品粉末约1.0 g，置索氏提取器中，加入80%乙醇回流提取至无色。残渣挥干乙醇，加水适量回流提取3次，30 min/次，抽滤，合并滤液置500 ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，备用。
       2.3  标准曲线的绘制精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品适量，配制成0.30 mg/ml的对照品溶液。分别精密量取该对照品溶液4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 ml置50 ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，备用。再精密量取上述稀释的对照品溶液各2.0 ml，按“2.2”项下自“加入4％苯酚溶液1.0 ml……”起，同法测定。以吸光度（Y）对葡萄糖质量浓度（X）进行回归分析，得出其回归方程为Y=0.013 7X-0.000 4 ，r=0.999 8，表明葡萄糖质量浓度在 24.05～54.11 μg /ml范围内呈现良好的线性关系。
       2.4  换算因子的测定取精多糖（60℃干燥至恒重）适量，加水配制成0.01 mg/ml的溶液。分别精密吸取精多糖溶液和葡萄糖对照品溶液2.0 ml，按“2.2”项下自“加入4％苯酚溶液1.0 ml……”起，同法测定。由回归方程计算精多糖溶液中葡萄糖的质量浓度，按以下公式计算换算因子：瘙
楋=W/（C×D）（W为精多糖质量，C为精多糖溶液中葡萄糖质量浓度，D为多糖溶液的稀释倍数）计算得换算因子瘙
楋=3.92（n=5）
       2.5  精密度实验精密吸取对照品溶液2.0 ml，按“2.2”项下自“加入4％苯酚溶液1.0 ml……”起，同法测定。连续测定5次，测定结果RSD为0.96%。
       2.6  稳定性实验精密吸取对照品溶液2.0 ml，按“2.2”项下自“加入4％苯酚溶液1.0 ml……”起，同法显色，每隔5 min测定一次吸光度。对60 min内显色稳定性进行了考察。测定结果RSD为1.15％，表明采用本法显色后在60 min内测定吸光度稳定。
       2.7  重复性实验取16号样品粉末约1.0 g，精密称定6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，同法测定。计算得样品多糖含量平均值为16.35%，RSD为1.52%。
       2.8  加样回收率实验 取已知含量的16号样品粉末（多糖含量16.35%）约0.5 g，精密称取6份，各加入红毛五加精制多糖约0.082 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，同法测定。按以下公式计算：回收率（%）=（C-A）/B×100% (式中A 为供试品中多糖含量；B为加入精多糖量；C为实测多糖含量 )计算得平均加样回收率为97.80％，RSD为1.59％。
       2.9  样品多糖含量测定茎皮样品测定方法为：取样品粉末1.0 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液并测定。木心样品溶液制备时，加水量减半，滤液转移置250 ml量瓶中，余同茎皮样品测定。按以下公式计算：多糖含量（%）=C×D×瘙
楋 /W×100（其中C表示供试品溶液中葡萄糖质量浓度，D表示稀释倍数，f为换算因子，W为样品质量）。结果见表1。表1  不同产地样品中多糖含量测定结果（略）
       3  讨论
        苯酚-硫酸法为测定多糖的经典方法之一。显色的苯酚、硫酸用量，显色时间、温度，放置时间等因素均会影响测定效果，本实验对各影响因子进行了单因素考察，确定了最佳显色条件为：2 ml供试品溶液中，加入4％苯酚溶液1.0 ml，摇匀，加入浓硫酸5.0 ml，40℃水浴加热15 min，置冰水中冷却5 min。溶液显色后1 h内稳定，前15 min内吸光度基本无变化，因此建议显色后15 min内进行测定，以减少误差。
        对最大吸收波长进行了考察。分别取葡萄糖对照品溶液、精多糖溶液和供试品溶液进行显色后，于400 ～700 nm全波长扫描，3种溶液的最大吸收波长分别为487，483和483 nm。因此，选择487 nm作为测定波长。
        对33批来源于4县7乡镇的自采对口药材、11批市场购买商品药材、8批产地购买药材，共计52批红毛五加皮样品进行了测定。结果表明茎皮多糖含量为8.79%～24.50%，平均含量为13.56%。因此，建议红毛五加茎皮的多糖含量不得低于10.9%。对11组相同来源的新、老枝茎皮的测定结果进行比较，其中5组的老枝茎皮含量高于新枝；6组新枝茎皮含量高于老枝，新、老枝茎皮的多糖含量无明显差异。对4组来源于同一样地的林窗、林下样品的测定结果进行比较，林窗样品的含量均高于林下样品，说明日照有利于多糖的积累。多糖的积累规律有待进一步研究。
        此外，本实验对10批木心样品进行了多糖含量测定，并与对应茎皮样品进行了比较分析。结果表明木心中多糖含量为5.78%～9.21%，平均含量为7.88%，木心多糖含量为对应茎皮含量的55.27%～83.22%。红毛五加的传统药用部位为茎皮，木心作为非药用部位常弃去。如能对木心加以利用，对于红毛五加资源的保护和综合开发有着积极意义。
       【参考文献】
         　　［1］郭 辉，张红旭，王 慧. 红毛五加多糖对体外正常人T淋巴细胞转化增殖的促进作用［J］. 中国药师，2005，8（10）：814.
       
       ［2］吕晓英，李 由，孙菊华，等. 红毛五加多糖诱导体外人胃癌细胞凋亡的研究［J］. 实用癌症杂志，2001，16（1）：6.
       
       ［3］张莅峡，刘 泓，常雅萍，等. 红毛五加多糖抗病毒效应的实验研究［J］. 中国中医基础医学杂志，1999，5（3）：25.
       
       ［4］冯 颖，王晶晶，孟宪军，等.无梗五加果粗多糖提取精制工艺研究［J］. 食品研究与开发，2006，27（8）：42.
       
       ［5］刘昌盛，黄凤洪，夏伏建.茶皂素脱色工艺研究［J］. 粮食与油脂，2004，12：26.