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       【摘要】 
       目的研究脑出血后的脑水肿形成与水通道蛋白4(AQP4)表达及Fe2+含量的关系,以及逐瘀安脑丸的干预作用。方法采用自体不凝血注入法制作大鼠脑出血模型, 采用干湿重法、免疫组织化学染色法, 测定脑含水量、AQP4蛋白的表达。结果与对照组相比,脑出血组、尼莫地平组、逐瘀安脑丸组均从脑出血后6h开始出现脑水肿(P<0.05),3 d时达到高峰(P<0.01),且逐瘀安脑丸组、尼莫地平组脑水肿低于脑出血组(P<0.05);AQP4表达同样在3 d时达到高峰(P<0.05)。在各时间点脑水肿程度与AQP4表达的变化呈显著正相关，6 h时(r=0.920,P<0.05)，1 d时(r=0.952,P<0.05)，3 d时(r=0.993,P<0.01)，7 d时(r=0.947,P<0.05)。对照组铁离子含量从6 h即开始上升,3 d时达到高峰,之后缓慢下降,7 d时仍高于正常(P<0.05); 尼莫地平组各时间点脑铁离子含量均低于对照组(P<0.05)，逐瘀安脑丸大剂量组3 d和7 d时间点上脑铁离子含量均低于尼莫地平组(P<0.05)。结论脑出血后AQP4、Fe2+表达明显增加,提示AQP4、Fe2+参与了脑水肿的发生发展过程,而逐瘀安脑丸可能通过降低Fe2+的含量以下调AQP4的表达，减轻脑出血后脑水肿的形成。
       【关键词】  脑出血　 脑水肿　 水通道蛋白4　铁离子
       Effect of Zhuyu Annao Pill on AQP4 and Fe2+ Expression and Cerebral Edema after Experimental Cerebral Hemorrhage in Rats
       WU Lin, LI Wenya,ZHANG Qirui,CHEN Wei
       1.The First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medical University,Nanning,Guangxi 530023, China;2.Graduate Student of 2006,Guangxi College of TCM,Nanning 530001,China
       Abstract：ObjectiveTo study the relationship between the cerebral edema after cerebral hemorrhage and AQP4,Fe2+ expression, and the interference effect of Zhuyu Annao Pill.MethodsThe ICH model was established by stereotaxic injection of auto-non-anticoagulated artery blood into the caudate nucleus,AQP4 were detected  expression by innumumohistochemistry and cerebral edema(cerebral water contents).ResultsCompared with control group,cerebral edema appeared in ICH group, Zhuyu Annao Pill group and nimodip group 6 h after cerebral hemorrhage(P<0.05),and cerebral edema in Zhuyu Annao Pill group, that in nimodipine group was lower than that of cerebral hemorrhage group(P<0.05).AQP4 expression reached the highest level at 3d(P<0.05). There was significant possitive correlation between the extent of brain edema and changes in AQP4 expression at each time, 6 h (r=0.920, P<0.05), 1 d, when (r=0.952,P<0.05), 3 d  (r=0.993, P< 0.01), 7 d (r=0.947,P<0.05). In control group, iron ion content began to increase  from 6 h, 3d peaked on the 3rd day, followed by a slow decline, it  was still higher than normal on the 7 th day (P<0.05);  brain iron ion content in nimodipine group at different time points were lower than that in control group (P<0.05).Brain iron ion content in high dose group was lower than that of nimodopine group on the 3 rd and 7 th day (P<0.05).ConclusionAQP4 expression increases significantly after cerebral hemorrhage,which suggests that APQ4 and Fe2+ involved in pathogenesis and development of cerebral edema.Zhuyu Annao Pill,can inhibit cerebral edema by reducing Fe2+ content and down-regutating the expression of AQP4.
       Key words：ICH;  Brain edema;  Aquaporin;  Fe2+
        脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是神经科的常见疾病,有较高的致死率和致残率。脑出血后的神经损伤除了血肿直接破坏脑组织和造成占位及压迫效应外,还包括一系列的病理生理过程,引起脑组织继发损伤,其中脑出血后脑水肿的发生机制是目前的研究热点。本实验通过动态观察脑出血大鼠的脑含水量及水通道蛋白4(aquaporin4, AQP4)的表达和铁离子的表达,以及逐瘀安脑丸的干预作用,研究脑水肿的发生机制,探索有效的防治办法。
       1  材料和方法
       1.1  动物分组及脑出血模型制作
       1.1.1  分组健康Wistar大鼠SPF级（广西药品检验所实验动物中心提供,许可证号SCXK桂2003-0001），80只,体质量250～350 g,雌雄不限，随机分成4组,即对照组、逐瘀安脑丸小剂量组、逐瘀安脑丸大剂量组、尼莫地平组,每组按造模后6 h、1 d、3 d和7 d时间点分成4个亚组,每个亚组各5只大鼠(n=5)。
       1.1.2  药品逐瘀安脑丸（水蛭、土鳖虫、地龙、桃仁、凌霄花、泽兰、酒大黄、川芎、猪苓、泽泻各10g），由江苏江阴天江药业有限公司提供中药配方颗粒。
       1.1.3  动物模型制作参照Rosenberg等的方法进行［1］。大鼠经10%水合氯醛(400 mg/㎏)腹腔注射麻醉后,固定于立体定位仪上,行头部正中纵行切口,剥离骨膜暴露前囟和冠状缝。于前囟前0.2 mm,中线向右旁开3.0 mm处钻一直径1.0 mm小孔。脑出血组大鼠用微量注射器从股动脉抽取适量血,在立体定向仪引导下经钻孔垂直进针,深度约6.0 mm(相当于右侧尾状核),缓慢注血80 μl，留针10 min后退针。对照组口服蒸馏水10ml/kg；逐淤安脑丸大剂量组口服逐瘀安脑丸12.5 g/kg，小剂量组予逐瘀安脑丸6.25 g/kg灌胃，给药于造模后4 h 1次，其后每天给药2次。尼莫地平组在建立模型后即刻给于腹腔注射尼莫地平50 μg/100 g，以后每天注射1次至实验结束。动物麻醉清醒后，参照Zealonga［2］等的5分制评分标准进行评分:0分:无神经缺损症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:行走时向对侧转圈;3分:站立不稳，向对侧倾倒;4分:不能自发行走，意识丧失。累积1分以上为成功模型。
       1.2  指标检测
       1.2.1  标本采集与处理分别在预定时间点将大鼠快速断头处死并取脑,在注血点作冠状切开,前半部分用于铁离子含量的测定,后半部分用于AQP4的测定,左侧脑组织做含水量测定。
       1.2.2  脑含水量将各时间点的前半脑组织分别用电子分析天平称重(湿重),然后置入95℃恒温箱中,24 h后取出再称重(干重)。以(湿重-干重)/湿重×100﹪来计算脑含水量,以此代表脑水肿的水平。
       1.2.3  脑组织AQP4的表达SP法检测AQP4表达:切片0.01%PBS漂洗、0.05%H2O2处理、10%正常羊血清封闭,滴加AQP4一抗(浓度为1∶6 000)置湿盒中4℃孵育过夜,滴加生物素标记的二抗,置于湿盒中37℃孵育30 min,滴加生物素过氧化物酶复合物,置于湿盒中37℃孵育20 min,DAB显色,苏木精对比染色,脱水透明后封固。免疫组织化学染色AQP4阳性细胞胞膜和胞腔呈棕黄色。阴性对照用0.1 mol/L PBS代替一抗进行孵育,其余步骤同前。采用采用北航（CM2000B）生物医学图像分析系统定量分析阳性细胞平均吸光度(A)值。
       1.2.4  脑组织铁离子含量的测定 取干脑组织先后加入浓硝酸（16 mol／L）5ml和高氯酸（12 mol／L）0.5 ml，加热消化至清亮，用原子吸收光谱法测定铁含量。
       1.3  统计学处理实验结果以±s表示,用SPSS 14软件进行统计处理。采用方差分析和q检验进行分析。
       2  结果
       2.1  脑含水量逐瘀安脑丸组与对照组相比,各时间点脑含水量明显下降(P<0.01);尼莫地平组各时间点脑含水量均低于对照组(P<0.05)，逐瘀安脑丸大剂量组各时间点脑含水量均低于尼莫地平组(P<0.05)。结果见表1。表1  ICH后不同时间点脑含水量(略)
       2.2  脑组织AQP4表达AQP4主要在血肿周围的星形胶质细胞表达,血管周围也呈明显的阳性表达。AQP4阳性反应产物主要表达在细胞膜上,强阳性时胞浆可有表达,细胞核不表达。光镜下：胞膜及胞浆显示棕黄色。对照组和治疗组6 h后AQP4表达水平增加(P<0.05),1 d时表达水平明显升高(P<0.01),3 d达到高峰,以后逐渐下降,7 d表达水平明显下降。与对照组比较,治疗组大鼠在各时间点AQP4均在低水平(P<0.05或P<0.01)，逐瘀安脑丸大剂量组各时间点脑含水量均低于尼莫地平组(P<0.05)。结果见表2及图1～4。表2  ICH后不同时间点AQP4吸光度(略)
       2.3  AQP4与脑组织含水量之间的相关性分析进行相关分析显示,脑出血6 h组AQP4表达水平变化与脑含水量变化直线相关分析呈正相关(r=0.920,P<0.05)，脑出血1 d组AQP4表达水平变化与脑含水量变化直线相关分析呈正相关(r=0.952,P<0.05)，脑出血3 d AQP4表达水平变化与脑含水量变化直线相关分析呈显著正相关(r=0.993,P<0.01)，7 d AQP4表达水平变化与脑含水量变化直线相关分析呈正相关(r=0.947,P<0.05)。表明在各时间点AQP4表达与含水量均有相关性。 
       2.4  脑组织铁离子含量对照组铁离子含量从6 h即开始上升,3 d时达到高峰,之后缓慢下降,7d时仍高于正常(P<0.05); 尼莫地平组各时间点脑铁离子含量均低于对照组(P<0.05)，逐瘀安脑丸大剂量组3 d和7 d时间点上脑铁离子含量均低于尼莫地平组(P<0.05)。结果见表3。表3  ICH后不同时间点铁离子含量(略)
       3  讨论
        逐瘀安脑丸是以广西名老中医吴子辉主任医师治疗脑出血的名方逐瘀安脑丸（水蛭、土鳖虫、地龙、桃仁、凌霄花、泽兰、酒大黄、川芎、猪苓、泽泻各10 g）为基础，利用江苏江阴天江药业的中药配方颗粒组方而成。该方针对出血后水肿的“瘀血阻滞，水毒潴留”之病机，采用“破血逐瘀，利水排毒”的治法治疗急性期脑出血，取得良好的疗效［3］。临床研究表明, 逐瘀安脑丸能抑制脑卒中神经元凋亡,保护受损神经元。另外,有研究证实逐瘀安脑丸能减少脑卒中后脑水肿形成,临床使用逐瘀安脑丸配合传统脱水剂治疗脑出血后脑水肿亦取得良好疗效。本实验研究逐瘀安脑丸减轻脑水肿的病理学机制。
        AQP4是中枢神经系统内分布最广泛的水通道蛋白,在大脑灰质和白质均有分布,在室管膜上皮细胞、软膜细胞、室旁核、视上核、齿状回的颗粒细胞层及小脑蒲肯野细胞层上也有表达,尤其在朝向血管及软膜面胶质细胞膜区AQP4选择性地高表达,提示AQP4是胶质细胞与脑脊液以及血管之间的水调节和运输的重要结构基础［4～7］。研究发现［8，9］,AQP4在各种原因(如缺血、出血、外伤、肿瘤等)引起的脑水肿的病理生理机制中均发挥重要作用［6］。本实验发现在脑出血组中,AQP4的表达于脑出血后6 h即开始升高,3 d时达到高峰后缓慢下降,7 d时仍高于正常水平;脑含水量在脑出血后6 h也开始升高,3 d时达到高峰,之后开始下降,7 d时仍然高于正常,与AQP4表达的变化一致,二者在各时间点均有相关性,与文献报道一致［10］。脑出血组AQP4表达水平和脑含水量在相应时间点上均高于对照组(P<0.05),提示AQP4在脑出血后脑水肿的形成过程中起着重要作用,AQP4表达的上调导致脑含水量的增加。逐瘀安脑丸组与脑出血组比较,AQP4表达明显下调,脑含水量明显减少(P<0.01)，提示逐瘀安脑丸通过抑制AQP4的表达而减轻脑水肿的形成。
        红细胞及血红蛋白(Hb)对脑出血后脑水肿形成的作用正逐渐被人们所重视。实验证实脑内注射血红蛋白及其降解产物血红素、氯化亚铁和胆红素都能在24 h内引起脑水肿。脑出血后脑内血红素加氧酶-1（HO-1）的表达上调，转铁蛋白(transferrin, Tf)和转铁蛋白受体（TfR）水平持续增高，并维持很长一段时间［11］。Wu等［12］观察到，在脑出血3 d后脑组织中HO-1达高峰。脑出血后，表达上调的HO-1可加速血红素的分解，使血红素分解为一氧化碳（CO）、铁离子（Fe2+）和胆绿素。而过量的自由铁聚集又可引起脑损伤，血红素加氧酶（HO）抑制剂可减轻脑水肿［13］。本实验研究发现,与对照组比较，逐瘀安脑丸组和尼莫地平组在不同时间点对大鼠ICH脑水肿的治疗均有明显的疗效。从Fe2+含量的变化看, 逐瘀安脑丸和尼莫地平两药对出血后脑水肿的治疗均有一定的效果。与尼莫地平组相比，逐瘀安脑丸组对大鼠血肿周围脑组织Fe2+含量的变化上有更好的疗效(P<0.01或P<0.05)。提示逐瘀安脑丸对大鼠ICH脑水肿有良好的治疗作用。
        ICH后低氧诱导因子(HIF-l)这种核转录因子的提高似乎可以为AQP4表达提高提供解释。HIF-1由HIF-la和HIF-lp组成。Bergeron等［14］在大鼠大脑中动脉永久梗死模型的缺血半暗带，发现HIF-lamRNA表达增高。与脑梗死相比，ICH后血肿周围出现缺血只是轻微的和一过性的，此种缺血是否足够诱导HIF-lamRNA表达增高尚无定论。然而，Riehard等［15］证实在非缺血缺氧条件下，凝血酶可使体外培养的平滑肌细胞HIF-la表达上调。Jiang等［16］更通过大鼠ICH模型发现凝血酶、红细胞裂解物均能使HIF-la表达上调。从以上文献可推侧，ICH后血肿中产生的Fe2+使HIF-la表达上调，HIF-la这种核转录因子又引起AQP4表达上调，从而导致血管上皮细胞、胶质细胞对水的通透性提高，大量水进入细胞内、组织间隙内引起脑水肿。
       
       本实验以自体不凝血致脑出血大鼠为模型，通过逐瘀安脑丸的干预研究逐瘀安脑丸对脑出血大鼠脑水肿和AQP4、Fe2+表达的影响，以期进一步了解逐瘀安脑丸抗脑出血作用及其可能机制。在本实验中，观察到AQP4 、Fe2+与脑含水量在各时间点均有显著关系，Fe2+使AQP4表达上调导致脑含水量增加;逐瘀安脑丸可降低Fe2+的含量以下调AQP4的表达,减轻脑水肿。表明逐瘀安脑丸可能通过降低Fe2+的含量以下调AQP4的表达参与ICH后脑水肿的发生发展, 逐瘀安脑丸有治疗ICH后脑水肿的作用。
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