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       【摘要】 
       目的观察冬凌草提取物对四氯化碳致小鼠慢性肝损伤的影响。方法小鼠皮下注射20% CCl4花生油溶液造成慢性肝损伤，末次给药24 h后测定血清中主要生化指标，以及观察肝组织病理学变化。结果冬凌草提取物能够显著降低血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平，降低总蛋白(TP)、白蛋白(ALB )和丙二醛(MDA)的含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，减轻肝组织变性、坏死程度，缓解肝组织的病理改变。结论冬凌草提取物对四氯化碳致小鼠慢性肝损伤有保护作用。
       【关键词】  冬凌草提取物; 慢性肝损伤; 复方益肝灵片; 四氯化碳; 小鼠
       Protective Effects of Isodon rubescens Extract on CCl4-induced Chronic Hepatic Injury in Mice
       YAO Huizhi1， LI Jixue1,2*,ZHENG Haina2
       (1.Pharmacological College of Henan University, Kaifeng, Henan 475004, China; 2. Phamacological Institute of Henan University, Kaifeng, Henan 475004, China)
       Abstract：Objective To observe the effect of Isodon rubsecens extact on CCl4- induced chronic hepatic injury in mice. MethodsThe chronic hepatic model was developed by injection of 20% CCl4 in mice. Sixty mice were divided into 6 groups with 10 mice in each group: normal control group(group A),model group (group B), Isodon rubescens small-,middle-,large-dose groups(group C1,C2,C3 ) and Compound liver-benepitino Remedy tablet control group (group D). The mice in group C1,C2,C3 were administered with I.rubescens at different doses for 8 weeks. The mice in group D were then administered with Compound liver-benepitino Remedy tablets. The levels of serum AST,ALT,SOD,MDA,TP,ALB were measured and pathological changes of liver tissue was examined after HE staining. ResultsI.rubescens could significantly decrease the level of serum ALT,AST,TP and ALB, reduce the content of MDA and significantly increase the activity of SOD in serum. There had no significant difference between I.rubescens and Compound liver-benepitino Remedy tablets.Conclusion I. rubescens has protective effects on the experimental chronic hepatic injury induced by CCl4 in mice.
       Key words：Isodon rubescens; Chronic hepatic injury; Compound liver-benepitino Remedy tablets; Carbon Tetrachloride; Mice
       冬凌草Isodon rubescens (Hemsl) Hara为唇型科香茶菜属植物,1991年我国卫生部批准干燥叶及其地上部分作为中药材。冬凌草味甘苦，性微寒，具清热解毒、消炎止痛、抗肿瘤等功效[1，2]。冬凌草提取物主要化学成分是贝壳杉烯类二萜，冬凌草甲素为其主要活性成分，还有一些三萜成分和挥发油[3]。冬凌草及其主要活性成分的良好作用引起了国内外学者的广泛关注，近30年来国内外学者对其进行了多方面的研究[4]。本研究从护肝的角度报道了冬凌草提取物对四氯化碳致小鼠慢性肝损伤及早期肝纤维化的影响,并初步探讨其作用机理。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器UV-754紫外可见分光光度计(上海科学精密仪器有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司制造)，LEICARM2135石蜡切片机(德国LEICA公司) ，光学显微镜(NIKON)。
       1.2 动物昆明种健康小鼠，雌雄各半，体质量(20±2)g，随机分组，由河南省实验动物中心提供(合格证号：2009A318)。
       1.3 药品 冬凌草购自河南省济源市药材公司，制备冬凌草提取物：将冬凌草全草2 kg用95%工业乙醇回流提取，提取液合并减压浓缩，在丙酮中溶解，加等体积的水，振荡后静置。倾倒出清液，用醋酸乙酯萃取，醋酸乙酯部分浓缩至浆状，干燥，即得冬凌草提取物粉末，HPLC法测定冬凌草甲素的含量为8.92 mg/kg。将冬凌草提取物用0.5% CMC-Na溶液配成所需浓度的溶液备用。复方益肝灵片(每片含水飞蓟素以水飞蓟宾为21 mg)，批号为081108，购自北京双鹤现代医药技术有限责任公司。复方益肝灵片研碎用0.5% CMC-Na溶液配成含水飞蓟宾2.1 mg/ml混悬液做阳性对照药。
       1.4 试剂四氯化碳(CCl4)，分析纯，批号20081231，购自天津市德恩化学试剂有限公司。谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒，谷草转氨酶(AST)测定试剂盒，超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，丙二醛(MDA)试剂盒，总蛋白(TP)测定试剂盒，白蛋白(ALB)测定试剂盒,其批号均为20081111，均购自南京建成生物工程研究所。
       2 方法
       2.1 实验方法小鼠随机分为6组，空白对照组(以下简称空白组，10只)，慢性肝损伤模型组(以下简称模型组，10只)，复方益肝灵阳性对照组(10只)，冬凌草提取物高、中、低剂量组各10只。预饲养1周后开始造模，除空白对照组外其余各组以20% CCl4花生油溶液腹部皮下注射，首次0.2 ml/10g,以后每5天注射20% CCl4 0.1 ml/kg，连续8周。造模前两天开始灌胃给药或0.5% CMC-Na溶液，一直持续到实验结束，1次/d，剂量为：空白组和模型组灌以0.5% CMC-Na 0.2 ml·(10g·d)-1;复方益肝灵组灌以0.42mg·(10g·d) -1,冬凌草提取物预防低、中、高0.08，0.04，0.02 g·(10g·d)-1,8周末各组小鼠末次灌胃后24 h取材，处死。取血完毕后处死小鼠，立刻剖开腹腔，暴露肝脏，取肝右叶约0.3 cm3,迅速投入10%福尔马林溶液中固定。石蜡包埋，制备病理切片，HE染色，光学显微镜观察肝细胞组织病理变化。分级标准：(-)表示肝组织无肿胀、坏死及炎症细胞浸润;(+)表示肝细胞轻度肿胀，单个肝细胞坏死，或少许炎性细胞浸润;(++)表示肝细胞中度肿胀，或肝细胞造性坏死，或有明显炎性细胞浸润;(+++)表示肝细胞重度肿胀，或肝细胞片状坏死，或大量炎性细胞浸润。
       2.2 观察指标及测定方法在实验过程中每天观察各组小鼠进食、饮水、活动情况及皮毛变化，每周称体重1 次,以便调整给药剂量，末次治疗后禁食24 h，自眼眶取血，1 000 r/min离心10 min，分离血清,用试剂盒测血清ALT，AST，SOD，MDA，TP，ALB。
       2.3 统计学处理数据以±s表示，配对t检验处理。采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析，判断组间差异，P<0.05被认为所检验的差别有统计学意义。
       3 结果
       3.1 小鼠一般情况 在实验过程中，空白组小鼠体质量自然增加，行动敏捷，食欲正常，皮毛密集有光泽;模型组小鼠精神萎靡，蜷卧少动，皮毛干涩，蓬松少华，食欲欠佳，体质量增长缓慢或不增长，尤以雌性小鼠明显。复方益肝灵及冬凌草提取物各剂量组小鼠精神、毛色及进食量均好于模型组。
       3.2 冬凌草提取物对小鼠慢血清性肝损伤血生化指标的影响从表1看出,模型组的血清ALT，AST 显著增高，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.001),冬凌草低、中、高剂量组血清的ALT，AST水平均低于模型组，与模型组比较有统计学意义(P<0.001或P<0.01)。模型组小鼠血清中的SOD的活性显著降低，与空白组比较有差异有统计学意义(P<0.01)，冬凌草各剂量组能不同程度的提高血清中SOD的活性，冬凌草各剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。模型组小鼠血清中的MDA的含量明显升高(P<0.01)，冬凌草各剂量组能明显的降低MDA的含量，复方益肝灵组及冬凌草各剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。表1 冬凌草提取物对血清ALT，AST， SOD，MDA水平的影响与空白组比较，***P<0.001, **P<0.01;与模型组比较，# # #P<0.001，##P<0.01;n=10表2 冬凌草提取物对血清TP，ALB，A/G的影响与空白组比较，**P<0.01;与模型组比较，# #P<0.01;# P<0.05;n=10
       从表2看出模型组的小鼠血清的TP，ALB的含量均将低，A/G(白蛋白/球蛋白)的比值明显降低，与空白组差异有统计学意义(P<0.01)。冬凌草提取物各剂量组TP、ALB、A/G均高于模型组，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)
       3.3 小鼠慢性肝损伤肝组织病理情况结果见表3。表3 各组小鼠肝脏HE染色病理变化与模型组比较，# #P<0.01;n=10
       HE染色显示空白组肝细胞正常无炎性细胞浸润;模型组见大鼠的肝细胞脂变，肝细胞浊肿脂变主要在小叶周边并伴有炎性细胞浸润;相比之下，冬凌草提取物各剂量组肝细胞脂变明显减少，变性细胞亦减少，细胞结构比较正常，与复方益肝灵组相似。病理结果显示CCl4所引起的肝损害主要表现在肝细胞的脂肪变性及化学炎症引起的炎症细胞聚集，长时间的持续毒害导致肝的肿大和脂变甚至肝的纤维化和肝硬化。表3结果提示冬凌草提取物对CCl4所致的肝组织病理改变有明显的改善作用。
       4 讨论
       慢性肝损伤类似临床慢性肝炎的病理变化，一般都伴有肝纤维化改变。肝纤维化(Hepatic fibrosis)是指肝脏纤维组织过度沉积，是纤维增生和纤维分解不平衡的结果[5]。慢性肝炎是我国的常见病和多发病，通常是由肝损伤引起，进而演变为肝纤维化，最终导致肝硬化[6]，因此探索其治疗方法有重要意义。目前对抗肝纤维化药物的研究比较多，中医中药尤其受到人们的极大重视，但有效且用于临床者较少。复方益肝灵(主要成分为水飞蓟素)在动物实验及临床方面都已经证实了具有保护肝细胞，降低转氨酶及抗肝纤维化等作用[7，8]。
       CCl4是制作肝损伤模型的常用药物，通过肝微粒体中的细胞色素P450代谢激活后生成的三氯甲基自由基(CCl3· )和氯自由基(CCl·),具有很强的诱导肝脏脂质过氧化的作用[9]。由于脂质过氧化反应增强而抗氧化能力下降，导致自由基增加，通过过氧化细胞膜脂质，使肝细胞结果和功能受到损害[10]。通过提高酶的活性和阻止脂质过氧化反应能够预防肝细胞毒性[11]。由于肝细胞坏死，细胞膜通透性增加，ALT,AST大量渗入血液，而使血中酶的活性增高。所以血清中转氨酶的活性的增高在一定程度上反映了肝细胞损害和坏死的程度。CCl4中毒引起的动物血清ALT,AST水平升高与肝细胞损伤程度粗略的呈平行关系[12]。实验中，模型组小鼠血清的ALT水平升高了15.2倍，AST升高了11.3倍，说明CCl4诱导的慢性肝损伤模型成功。与模型组相比，冬凌草各剂量组能明显降低AST和ALT的水平(P<0.001;P<0.01),并且高剂量组与复方益肝灵组保护组没有显著性差异(P>0.05)。SOD是细胞内天然的氧自由基清除剂，而MDA则是氧自由基与细胞膜表面不饱和脂肪酸(脂质过氧化反应)产物;小鼠腹腔注射CCl4导致慢性肝损伤时，过量的氧自由基产生于肝组织细胞并对其产生损伤时会引起SOD水平下降，MDA含量升高[13]。慢性肝损伤时，氧化应激，特别是脂质过氧化，细胞因子的生成导致肝星细胞活化和增殖，活化的肝星形细胞合成分泌以致胶原蛋白为主的细胞外基质在肝内沉积引起肝脏纤维化。
       慢性肝损伤主要表现为白蛋白下降，球蛋白增加，白蛋白与球蛋白的比值逐渐减小，血清ALB、A/G与肝组织病理分级及纤维化分期均有相关性[14]。模型组正常肝小叶结构破坏，有广泛的脂肪变化，肝细胞血清ALB含量的高低可反映肝脏合成蛋白质的功能，ALB是肝脏细胞特异分泌的功能性蛋白，肝细胞受损，合成蛋白质功能障碍，血清ALB减少。模型组相比，肝功能受到损害时，血清中总蛋白和白蛋白明显下降(P<0.01)，反映肝脏制造蛋白的能力已经受到影响，提示出现肝纤维化的血清学改变。
       本实验结果表明，CCl4可致小鼠大量肝细胞变性坏死，使网状支架塌陷，促进纤维组织增生形成肝纤维化，并且可使ALT，AST升高，TP，ALB，A/G降低，表明模型制作成功。而给予冬凌草提取物后能有效地保护CCl4给药后小鼠肝细胞，使细胞损伤程度降低，表现在能降低血清ALT，AST水平，提高SOD的活性，降低MDA的含量，使TP，ALB，A/G升高;组织病理学检查结果也说明它能改善慢性肝损伤的病理改变。提示冬凌草提取物具有明显的保肝降酶作用，通过抑制脂质过氧化反应，稳定肝细胞膜而达到抗慢性肝损伤和肝纤维化过程的。
       【参考文献】
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