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       【摘要】 
       目的研究以聚乳酸-羟基乙酸共聚物 [poly(D，L-lactic-co-glycolic)acid，PLGA]为佐剂制备的蒿属花粉纳米疫苗对小鼠过敏性哮喘模型气道炎症治疗的疗效, 并探讨其免疫治疗机制。方法40只小鼠随机分为5组：对照组、模型组、空白粒子治疗组(治疗A组)、蒿属花粉粗浸液治疗组(治疗B组)、PLGA -蒿属花粉治疗组(治疗C组)。用蒿属花粉建立哮喘模型。对照组用生理盐水代替致敏。ELISA法检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和脾细胞培养上清液(SCCS)中IL-4，IFN-γ的含量;收集BALF进行总细胞计数和嗜酸性粒细胞计数;HE染色观察各组小鼠肺组织病理变化。结果肺部组织学和BALF中细胞计数结果显示，与模型组相比，B、C组的肺部嗜酸性粒细胞浸润显著减轻，BALF中总细胞和嗜酸性细胞显著减少;细胞因子的测定结果显示，在BALF中，模型组的IL-4和IFN-γ分别为(88.71±6.82) pg/ml和(24.14±2.91) pg/ml，与之相比，蒿属花粉粗浸液治疗组(40.07±2.42) pg/ml和PLGA-蒿属花粉治疗组( 38.31±6.28) pg/ml的IL-4显著降低( P<0.01);PLGA-蒿属花粉治疗组( 63.69±8.0) pg/ml的IFN-γ显著升高(P<0.01);在SCCS中，模型组的IL-4和IFN-γ分别为( 81.02±12.5) pg/ml和( 34.12±4.64) pg/ml，与之相比，蒿属花粉粗浸液治疗组( 58.91±9.10) pg/ml和PLGA-蒿属花粉治疗组( 41.30±4.75) pg/ml的IL-4分泌显著减少( P<0.01) ;PLGA-蒿属花粉治疗组(82.50±5.63) pg/ml的IFN-γ显著增高(P<0.01)。结论PLGA -蒿属花粉纳米疫苗免疫治疗小鼠哮喘有良好疗效。其机制可能与调节Th1/Th2平衡有关。
       【关键词】  聚乳酸-羟基乙酸共聚物; 哮喘; 蒿属花粉; 纳米粒子; 免疫治疗
       过敏性疾病是目前世界性重大卫生问题之一，常见的有过敏性哮喘和过敏性鼻炎等。哮喘是一种以肺部嗜酸粒细胞浸润和对各种激发因子产生气道高反应为特征的慢性气道炎性疾病，是一种常见病和多发病，且发病率有逐年上升的趋势[1，2]。目前认为，哮喘的发生与机体的Th1/Th2免疫功能失衡有关，哮喘患者体内T细胞趋向于产生高水平的Th2细胞因子(IL-4、IL-5等)，而Th1细胞因子(IFN-γ)水平相对较低[3]。
       聚乳酸-羟基乙酸共聚物( PLGA) 是一种生物相容性良好的可降解材料[4]，可促进变应原直接被抗原呈递细胞吸收，在生物体内缓慢释放变应原。Scholl等[5]的实验证实，用PLGA包裹变应原可有效地诱导抗体IgG的产生，但PLGA -蒿属花粉纳米疫苗在治疗小鼠哮喘的作用目前未见相关报道。本实验通过物理方法制备包裹蒿属花粉变应原的PLGA纳米疫苗, 研究该疫苗对蒿属花粉变应原诱导的小鼠哮喘的免疫保护作用, 并探讨其作用机制。
       1 材料
       动物选用健康Balb/C小鼠40只，4～6周龄，雌雄不限，体质量(18±2)g。
       2 方法
       2.1 蒿属花粉变应原的制备按杨慧等[6]的方法进行。
       2.2 PLGA -蒿属花粉纳米粒子的制备采用超声乳化法，以PLGA为包裹材料，制备PLGA-蒿属花粉纳米粒子。将50 mg的PLGA溶于1 ml的二氯甲烷中，再加入蒿属花粉变应原100 μl，混旋1 min，超声乳化30 s，再加入2%的聚乙烯醇(PVA)2 ml，混旋1 min，超声乳化30 s，最后将上述溶液滴入正在搅拌状态的50 ml的双蒸水中，使之迅速分散，低速搅拌4 h，以挥发有机溶剂。扫描电镜观察粒子形态和大小，BCA蛋白质定量法测定纳米粒子载药量。
       2.3 小鼠哮喘模型的建立和免疫治疗40只小鼠随机分为5组：对照组、模型组、治疗A组(空白粒子组)、治疗B组(蒿属花粉粗浸液组)、治疗C组(PLGA -蒿属花粉治疗组)。第1天，模型组和治疗组小鼠腹腔注射(i.p.)致敏液[1 mg Al(OH)3+10 μg蒿属花粉变应原]后，治疗组分别用空白粒子、蒿属花粉粗浸液、纳米粒子-蒿属花粉s.c.进行免疫治疗。第8，15，22天再次用相同的致敏液致敏，处死小鼠的前3 d给予0.2%变应原浸液滴鼻(i.n.)，连续3 d，1次/d，诱发哮喘发作。对照组用生理盐水代替致敏。
       2.4 实验动物的处死及标本采集颈椎脱臼法处死小鼠，气管插管，用预冷的PBS进行肺泡灌洗，每次注入PBS液0.8 ml，重复3次，要求回收率大于75%且无血液混入。收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。无菌操作完整分离动物脾脏，制备脾细胞悬液，于CO2恒温培养箱培养72 h，收集脾细胞培养上清液(SCCS)，于-70℃保存。分离动物肺脏，置于10%甲醛组织固定液，4℃保存。
       2.5 支气管肺泡灌洗液细胞计数将所收集的BALF离心，取细胞沉淀，用0.4 ml PBS液重新混悬，计数细胞总数，并涂片行瑞氏染色，油镜下记数300个细胞，进行白细胞分类。
       2.6 BALF及SCCS中细胞因子水平检测按照IFN-γ、IL-4相应ELISA试剂盒说明书上的实验步骤规范操作，酶标仪检测A450值。
       2.7 肺组织病理切片制备及观察将保存于10%甲醛组织固定液中过夜的肺组织进行常规取材，HE染色。光学显微镜40×物镜随机视野观察肺组织形态、气道上皮损伤、气管及血管周围嗜酸性粒细胞(Eos)炎性浸润情况;选择视野进行显微摄影。
       2.8 统计学分析运用统计软件SPSS for Windows Ver 12.0进行实验数据的统计分析处理，实验数据以±s表示，组间差异性进行两样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
       3 结果
       3.1 PLGA-蒿属花粉纳米疫苗的特征PLGA-蒿属花粉纳米疫苗在扫描电镜下呈椭圆形、光滑的颗粒(图1)，其平均粒径为550～750 nm。蒿属花粉的载药量为400μg/10 mg(即为4%)。
       图1 蒿属花粉-纳米粒子的扫描电镜图谱
       3.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数和嗜酸粒细胞计数 对照组BALF中的细胞总数较少，细胞分类以单核细胞和淋巴细胞为主，占85%以上;与对照组相比，模型组BALF中的细胞总数和嗜酸粒细胞明显增加(P<0.01);与模型组相比，蒿属花粉粗浸液治疗组和PLGA-蒿属花粉治疗组的细胞总数和嗜酸性粒细胞显著减少(P<0.01)，空白粒子组与模型组相比无明显改变。见表1。表1 BALF中总细胞数和嗜酸粒细胞数
       3.3 BALF及SCCS中细胞因子水平检测在BALF中，模型组的IL-4和IFN-γ分别为(88.71±6.82) pg/ml和(24.14±2.91) pg/ml，与之相比，蒿属花粉粗浸液治疗组(40.07±2.42) pg/ml和PLGA-蒿属花粉治疗组( 38.31±6.28) pg/ml的IL-4显著降低( P<0.01);PLGA-蒿属花粉治疗组( 63.69±8.0) pg/ml的IFN-γ显著升高(P<0.01)，蒿属花粉粗浸液治疗组( 30.87±4.63) pg/ml的IFN-γ无明显改变(P>0.05);在SCCS中，模型组的IL-4和IFN-γ分别为( 81.02±12.5) pg/ml和( 34.12±4.64) pg/ml，与之相比，蒿属花粉粗浸液治疗组( 58.91±9.1) pg/ml和PLGA-蒿属花粉治疗组( 41.3±4.75) pg/ml的IL-4分泌显著减少( P<0.01) ;PLGA-蒿属花粉治疗组(82.5±5.63) pg/ml的IFN-γ显著增高(P<0.01) ，蒿属花粉粗浸液治疗组( 40.45±5.67) pg/ml的IFN-γ无明显改变(P>0.05)。见图2和图3。
       3.4 肺组织病理学检察与对照组相比，模型组小鼠的支气管、细支气管上皮下和小血管周围有明显的炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，气道上皮结构紊乱，有部分脱落，肺泡间质增厚，也可见到炎性细胞浸润。治疗B、C组小鼠肺组织切片观察可见，炎症反应明显减轻，炎性细胞浸润较模型组显著减少，气道上皮结构基本恢复正常。
       4 讨论
       过敏性支气管哮喘是I型速发型变态反应性疾病，是以气道高反应性、肺部嗜酸细胞性炎症为特征。哮喘在发病的过程中,起主要作用的是T淋巴细胞，是以Th2型反应为主要特征的免疫反应。其Th2反应增强而Thl反应减弱，导致机体Thl/Th2失衡。因此调节Th1/Th2的反应失衡对哮喘有预防及免疫治疗作用[7]。
       本实验通过腹腔注射致敏,并用多次滴鼻的方法成功使用蒿属花粉提取液制作出BALB/c小鼠的肺部炎症模型。与对照组相比，模型组BALF和SCCS中IL-4的浓度显著增多，而IFN-γ中的浓度显著减少，结果显示Th2型的细胞因子占优势;模型组BALF中的细胞总数和嗜酸性粒细胞数量显著增加;在肺组织切片中可观察到模型组小鼠气道粘膜明显水肿，粘膜基底层增厚，气道粘膜层、粘膜下层、血管周围组织、肺泡壁及肺泡腔内有大量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，肺泡腔巨噬细胞也增多，肺泡膈增厚。这些都证实我们成功构建了蒿属花粉致敏的BALB/c小鼠哮喘动物模型。
       A-模型组 B-蒿属花粉粗浸液组 C-PLGA纳米粒子组
       图4 肺组织病理变化(HE 染色, 200×)
       乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是研究中常用的疫苗控释载体材料。PLGA纳米粒包裹或吸附的蛋白质一般在24 h内经历首次突发释放，可占其负载量的50%，其后进入缓慢释放的阶段长达一月之久，可减低大剂量变应原诱导的副作用。PLGA最终在体内降解为二氧化碳和水，已经被美国FDA批准可以作为临床药用的辅助材料，在临床上已证实其大剂量安全性[8]，具有良好的临床应用前景。喻海琼等[9]研究表明，以PLGA为佐剂包裹OVA纳米疫苗, 制成生物可降解型聚合物纳米粒子，可预防哮喘嗜酸性气道炎症，其可能的机制之一是调节了过敏性哮喘的Thl/Th2失平衡反应。
       本实验证实，在蒿属花粉粗浸液和PLGA治疗组中，BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞计数比模型组显著降低;BALF和SCCS中，IL-4的浓度比模型组浓度显著降低;同时，PLGA治疗组IFN-γ浓度比模型组显著增高，而蒿属花粉粗浸液组与模型组无统计学差异;分析其原因可能是PLGA-蒿属花粉纳米粒子可选择性激发Th1 CD+4T细胞的免疫应答，分泌IFN-γ，该结果与Batanero等[10]的研究结果相吻合。由肺组织病理变化的实验结果可见，蒿属花粉粗浸液和PLGA治疗组可明显抑制气道炎症现象，即气道上皮结构较正常, 无明显嗜酸性粒细胞浸润。这说明PLGA-蒿属花粉纳米疫苗不仅具有与蒿属花粉粗浸液相同的下调Th2细胞因子表达和抑制嗜酸性粒细胞的作用，而且还具有蒿属花粉粗浸液所没有的诱导Thl细胞因子表达的作用，说明其可能通过调节Thl/Th2平衡而达到对哮喘的有效预防和治疗。因此，新型、安全的PLGA-蒿属花粉变应原纳米疫苗有望成为治疗变态反应性疾病的一种新途径。
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