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       【摘要】 
       目的建立独活药材与饮片中二氢欧山芹醇当归酸酯的HPLC分析方法。方法采用Shiseido C18 MG(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-水(49∶51)为流动相，流速1 ml·min-1，检测波长330 nm，柱温30℃。结果二氢欧山芹醇当归酸酯在0.003 6～1.536 mg·ml-1呈良好的线性关系，r=0.999 9，平均回收率为99.1 %(RSD=2.8 %)。22批不同产地独活药材与饮片中二氢欧山芹醇当归酸酯的质量分数在0.058 %～0.778 %，平均值0.178 %。结论该方法简单、重复性好，可用于独活的质量控制。
       【关键词】  独活; 二氢欧山芹醇当归酸酯; 高效液相色谱
       Determination of Columbianadin in Radix Angelicae Pubescentis by HPLC
       WANG Rui1,2, CHEN Haiyun3, YANG Qiwei1, HUANG Shanjun1, WANG Zhengtao1,2*
       (1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2. Shanghai R&D Center for Standardization of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 3. School of Chemistry and Biotechnology, Yunnan Nationalities University, Kunming, 650031, China)
       Abstract：ObjectiveTo develop a quantitative method for determination of columbianadin in Radix Angelicae Pubescentis. MethodsThe samples were separated at 30℃ on a Shiseido C18 MG (5 μm，4.6 mm×250 mm) column eluted with acetonitrile-water (49∶51) as the mobile phase. Flow rate was set at 1.0 ml·min-1 and the detection wavelength was set at 330 nm. ResultsThe calibration curve was linear within the range from 0.0036 to 1.536 mg·ml-1 (r =0. 999 9) and the average recovery was 99.1 % (RSD=2.8 %). 22 batches of the drugs purchased from different areas were determined and the contents of columbianadin in Radix angelicae pubescentis were fluctuated from 0. 058 % to 0.778 %. ConclusionThe method is simple, repeatable and can be used for the quality control of Radix Angelicae Pubescentis.
       Key words：Radix Angelicae Pubescentis; Columbianadin; HPLC
       独活为常用中药，为伞形科植物重齿毛当归 Angelica pubescens Maxim.f. biserrata Shan et Yuan的根，具有祛风除湿、通痹止痛之功效，用于治疗风寒湿痹、腰膝疼痛、少阴伏风头痛[1]。药理研究表明，独活中的香豆素类成分具有抑制血小板聚集、抗炎、镇痛等作用[2，3]。对独活及其制剂中甲氧基欧芹素等香豆素类成分的含量测定已有文献报道[4～7]，但尚未见对独活药材和饮片(又称二氢欧山芹素，Columbianadin)含量测定的相关报道。现行《中国药典》以蛇床子素作为指标成分建立独活药材的定量分析方法，但蛇床子素并非独活的特征性成分，缺乏专属性。
       本研究选择二氢欧山芹醇当归酸酯为指标成分，建立了独活药材和饮片(净片)的高效液相色谱含量测定方法，具有一定的专属性，并测定了22批不同产地独活药材和饮片中二氢欧山芹醇当归酸酯的含量，为完善独活的质量标准提供了实验数据，对保证其质量具有重要意义。
       1 仪器与试药
       高效液相色谱仪(日本岛津公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、检测器、工作站);乙腈(色谱纯，德国Merck公司);水(纯净水);其它试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。二氢欧山芹醇当归酸酯对照品由上海中药标准化研究中心制备，经HPLC检测纯度>98%。
       独活药材10批，饮片(净片)12批，由上海中药标准化研究中心吴立宏博士收集并鉴定，标本保存在上海中药标准化研究中心。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件 Shiseido C18 MG色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流动相为乙腈-水(49∶51);检测波长330 nm;流速1.0 ml·min-1;柱温30℃;进样量10 μl。理论板数按二氢欧山芹醇当归酸酯计算应不低于5 000。对照品和样品的HPLC图见图1。
       2.2 对照品溶液的制备 精密称取二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量，加甲醇制成每毫升含50 μg的溶液，即得。
       2.3 供试品溶液的制备 取样品粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 ml，密塞，称定重量，超声提取30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
       A-对照品 B-样品 1-二氢欧山芹醇当归酸酯
       图1 对照品及样品的HPLC图谱
       2.4 线性关系考察 取二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含二氢欧山芹醇当归酸酯1.5 mg·ml-1对照品贮备溶液。分别精密吸取不同体积的对照品储备溶液，制成不同浓度的系列溶液，按上述色谱条件测定，进样10 μl，分别以对照品的浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，得回归方程为Y =25 776 X -2.413 6，r=0.999 9，线性范围0.003 6～1.536 mg·ml-1。
       2.5 检测限和定量限 取对照品溶液，用甲醇依次稀释制成系列浓度由高到低的溶液，测得二氢欧山芹醇当归酸酯的检测限(S/N=3)为0.06 μg·ml-1，定量限(S/N=10)为0.2 μg·ml-1(RSD=2.7%)。
       2.6 精密度实验取同一供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，测得二氢欧山芹醇当归酸酯色谱峰面积的RSD为0.5%，精密度良好。
       2.7 重复性实验 取同一样品6份，精密称定，按“2.3”项下操作，在上述色谱条件下进样测定，测得二氢欧山芹醇当归酸酯色谱峰单位峰面积RSD为1.4 %。
       2.8 稳定性实验取同一样品粉末约0.5 g，精密称定，按“2.3”项下操作，在上述色谱条件下，分别于0，1，8，24，48，72 h进样分析，测得二氢欧山芹醇当归酸酯色谱峰面积的RSD为0.8 %，表明样品溶液在72 h内稳定。
       2.9 加样回收实验 取已知含量的独活粉末9份，精密称定，分别按已知含量的50%，100%和150% 3个水平加入二氢欧山芹醇当归酸酯对照品，按“2.3”项下操作，在上述色谱条件下进样测定，平均回收率为99.1 %(RSD=2.8 %)。
       2.10 样品测定 分别取独活样品粉末约0.5 g，精密称定，按“2.3”项下操作，制成供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl进样分析，计算含量。结果见表1。
       3 讨论
       本研究建立了独活中二氢欧山芹醇当归酸酯的HPLC含量测定法，并测定了22批独活药材和饮片(净片)中二氢欧山芹醇当归酸酯的含量，方法简便，稳定可靠，重复性好，可用于独活的质量控制。表1 独活中二氢欧山芹醇当归酸酯的含量测定结果
       No.商品名产地/收集地质量分数(%) 1独活 药材四川菘藩0.146 2独活 药材湖北恩施0.091 3独活 药材甘肃0.092 4独活 药材湖北巴东0.285 5独活 药材湖北巴东0.778 6独活 药材四川成都阿坝0.092 7独活 药材安徽0.116 8独活 药材四川0.081 9独活 药材四川0.202 10独活 药材四川0.173 11独活 饮片四川菘藩0.156 12独活 饮片湖北恩施0.109 13独活 饮片甘肃0.110 14独活 饮片四川/亳州足珍0.306 15独活 饮片甘肃/河南中原正信0.097 16独活 饮片四川/哈尔滨三棵树0.214 17独活 饮片河北安国0.058 18独活 饮片湖南0.342 19独活 饮片安徽0.081 20独活 饮片四川0.091 21独活 饮片上海0.128 22独活 饮片上海0.171
       n=3
       不同批次独活中二氢欧山芹醇当归酸酯的质量分数在0.058%～0.778%，均值0.178 %，按均值下浮50%计算，其中质量分数在0.089 %以上的样品占86.4%，为独活新质量标准的制定提供参考。
       在供试品溶液制备方法上，对提取溶剂(正己烷、乙醇、甲醇)、提取方法(冷浸、超声振荡、直接回流)、提取时间(15，30，45，60 min)和提取溶剂量(10，20，30，40倍)进行考察，最终确定提取方法为20 ml甲醇超声提取30 min。
       耐受性试验中，对不同色谱柱(Shiseido C18 MG，VARIAN Polaris C18-A，Ultimate XB-C18，Ultimate AQ-C18;5 μm，4.6 mm×250 mm)进行考察，结果均符合含量测定要求，耐受性良好。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：185.
       
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