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       【摘要】 
       目的研究蜕皮甾酮对非酒精性脂肪性肝病大鼠模型的防治作用并探索其可能的作用机制。方法采用改良高脂膳食喂养法建立大鼠非酒精性脂肪性肝病模型。♂SD大鼠48只, 随机分为正常对照组、模型组、蜕皮甾酮处理组与吡格列酮处理组, 每组12只。模型组应用改良高脂饲料喂养, 蜕皮甾酮组与吡格列酮组在高脂饲料喂养同时应用药物灌胃，正常对照组应用基础饲料喂养。实验12周末，处死所有大鼠，观察检测肝脏指数, 血清与肝组织生化指标及肝组织病理改变。结果蜕皮甾酮组和吡格列酮组血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)明显低于模型组;蜕皮甾酮和吡格列酮组与模型组相比肝组织丙二醛(MDA)水平降低明显, 超氧化物歧化酶(SOD)活力增加显著;蜕皮甾酮肝脏指数显著降低;肝组织脂肪变性程度和炎症活动度明显减轻。结论蜕皮甾酮具有改善高脂饮食诱发的非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏酶学，通过增加肝组织SOD的含量和减少MDA的含量来减轻肝组织氧化应激水平，发挥防治非酒精性脂肪性肝病的作用。
       【关键词】  非酒精性脂肪性肝病; 蜕皮甾酮; 肝指数; 病理检查; 氧化应激
       Protective Effects of the Ecdysterone on Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Rats
       LI Xiaoyun1，LI Wanghui2，LI Peng3*
       (1.Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000,China; 2.General Hospital of Guangzhou Military Area, Guangzhou 510010, China; 3. Central Hospital of Mianyang, Mianyang 621000, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Ecdysterone on nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) in rats and possible mechanism.MethodsRat model of NAFLD was established by highfat diet. A total of fortyeight male Sprague Dawley rats were randomly divided into four groups: highfat diet(model group ), highfat diet plus Ecdysterone (Ecdysterone group), highfat diet plus Pioglitazone (Pioglitazone group)and normal basic food(normal control). At the end of the 12th week, all rats were weighed, narcotized, sacrificed, and the liver index, biochemical indicators in serum and liver tissues and the hepatic pathological changes were observed.ResultsAt the end of the 12th week in Ecdysterone group, compared with model group, the serum levels of cholesterol (TC), triglyceride (TG),alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were reduced markedly, the tissue content of malondialdehyde (MDA) was decreased evidently, the activity of superoxide dismutase (SOD) was enhanced notably, the liver index was significantly decreased, and the degree of fatty degeneration and inflammation were relieved dramatically. ConclusionThe effect of Ecdysterone in preventing NAFLD in rats may be related to the decrease of MDA comtent and the increase of SOD activity in hepatic tissue.
       Key words： Nonalcoholic fatty liver disease ; Ecdysterone; Liver index; Pathological examination; Oxidative stress
       非酒精性脂肪性肝病( NAFLD)包括单纯性脂肪肝及由其演变的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和NASH相关性肝纤维化、肝硬化, 是一类与遗传环境代谢应激相关的肝脏疾病谱[1]。积极预防及治疗非酒精性脂肪性肝病对阻止慢性肝病的进展及改善预后具有重要意义，蜕皮甾酮是植物中提取的单体成分，是一种类固醇激素, 具有较强的抗氧化、清除自由基、降血糖、降血脂及降低血压作用[2]。我们通过观察其对改良高脂膳食复制的大鼠脂肪肝模型的影响, 以探讨蜕皮甾酮对大鼠NAFLD的防治作用及其可能作用机制。
       1 材料
       SPF级♂SD大鼠48只, 由泸州医学院实验动物中心提供, 体质量150～180 g。胆固醇胆酸钠购于重庆腾鑫生物技术有限公司; 丙硫氧嘧啶片购于上海朝晖药业有限公司;盐酸吡格列酮为江苏恒瑞医药股份有限公司产品;蜕皮甾酮为昆明昌宁德康生物科技有限公司提供; 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
       2 方法
       2.1 分组48只SD大鼠适应性喂养1周后按完全随机分组原则分为4组，正常对照组(n =12)，模型组(n =12)，蜕皮甾酮(10 mg·kg-1·d-1)治疗组(n=12)和吡格列酮处理组(n= 12)。正常对照组喂以普通基础饲料;模型组采用改良高脂饲料喂养(改良高脂饲料配方为:胆固醇2%，胆酸钠0.5%，丙硫氧嘧啶0.2%，蔗糖5%，猪油10%，基础饲料82.3%)[3];蜕皮甾酮治疗组在改良高脂饲料喂养的同时予蜕皮甾酮(10 mg·kg-1·d-1)灌胃; 吡格列酮处理组在高脂饲料喂养的同时予吡格列酮灌胃。各种药物均溶于生理盐水，正常对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。各组自由饮水进食，于12周末处死。大鼠处死前，均隔夜禁食; 称取体质量; 次日以0.2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，心脏采血; 打开腹腔，首先肉眼观察肝脏情况，然后迅速取出肝脏称肝湿重; 取肝左叶组织1.0 g, 4℃研磨制备成100 g/L的肝组织匀浆; 取肝左叶同部位组织1块, 40 g/L中性甲醛溶液固定。
       2.2 肝指数计算处死大鼠时，称量体质量及肝脏湿重。肝指数(%) = 肝湿质量/体质量×100%。
       2.3 生化指标检测血样经离心, 取血清, 使用全自动生化分析仪测定丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶( AST)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)等指标。肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量按试剂盒说明操作。
       2.4 病理学检查肝组织标本经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚切片, HE染色;光镜下观察肝细胞脂肪变性程度及炎症活动度。根据脂滴细胞数所占面积/总细胞数所占面积之比值为0, ≤1/3, ≤2/3和>2/3分为(-)(+++)4级, 达到2级或以上者诊断为脂肪肝;炎症活动度积分标准分为汇管区炎症(P)、小叶内炎症(L)、碎屑样坏死(PN)和桥接坏死(BN)4级, 每项根据病变程度分别计1～4分, 因为碎屑样坏死和桥接坏死严重度与预后直接相关, 故计2倍分，计分公式为P+L+2PN+2BN[1]。同时通过HE染色观察肝脏组织纤维化程度。
       2.5 统计学方法采用SPSS14.0软件进行统计学处理, 计量资料以 ±s表示;采用t检验，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
       3 结果
       3.1 一般情况实验期间对照组动物精神充沛, 灵活好动, 进食饮水正常, 皮毛光泽度好, 体质量持续小幅增长; 蜕皮甾酮组大鼠一般情况也较好; 模型组大鼠身体肥胖, 体毛凌乱, 色泽蜡黄,精神萎靡, 反应迟缓。
       3.2 肝指数及体质量模型组和蜕皮甾酮处理组各有1只大鼠因灌胃窒息而死亡。 吡格列酮处理组有2只大鼠因灌胃窒息死亡。实验结束时模型组体质量、肝湿重和肝指数明显增高，与正常对照组比较有显著性差异;而蜕皮甾酮组、吡格列酮组体质量、肝湿重和肝指数明显降低，与模型组比较有显著性差异; 蜕皮甾酮处理组和吡格列酮处理组之间无显著性差别(P>0.05) 。结果见表1。表1 各组大鼠体质量、肝湿重、肝指数测定结果与正常对照组相比较，* P<0.01;与模型组比较，△P<0.05;#P<0.01
       3.3 生化指标
       3.3.1 血清生化指标模型组大鼠血清ALT，AST较正常组明显升高(P<0.01);蜕皮甾酮处理组和吡格列酮处理组大鼠血清ALT，AST与模型组相比显著下降(P<0.05);蜕皮甾酮处理组和吡格列酮处理组之间差异无显著性(P>0.05)。与正常组相比，模型组大鼠血清TC水平明显升高(P<0.01)，TG水平与正常组基本相似。与模型组相比，蜕皮甾酮处理组和吡格列酮处理组血清TG无显著改变，而TC水平却显著下降(P<0.05)，两组间无明显差异。结果见表2。
       3.3.2 肝组织氧应激、脂质过氧化程度指标与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠血清MDA含量显著增高(P<0.01)，SOD活力明显下降(P<0.01)，蜕皮甾酮处理组和吡格列酮处理组MDA水平显著低于模型组(P<0.01), 而高于正常对照组; 蜕皮甾酮处理组和吡格列酮处理组SOD活力显著高于模型组(P<0.01), 而低于空白对照组，两组间差异不明显。见表2。表2 各组大鼠血清生化指标及肝组织匀浆SOD、MDA的含量与正常对照组比较，* P<0.01;与模型组比较，△P<0.05;#P<0.01
       3.4 肝组织病理学结果肉眼下观察，正常对照组肝脏颜色红润, 表面光滑,质软;模型组肝脏体积明显增大, 饱满圆钝，色黄油腻,质脆;蜕皮甾酮处理组和吡格列酮处理组肝脏体积较正常对照组增大，边缘稍钝，但大多颜色红润, 油腻程度较模型组明显减轻。HE染色光镜下观察, 正常对照组肝细胞排列整齐, 肝组织形态学正常(图1);模型组表现为弥漫性中度或重度脂肪变性, 以大泡性脂肪变为主，肝细胞肿胀呈气球样变, 大小不均, 胞质内出现大小不一的脂滴，肝细胞核被挤压移位,并可见炎性细胞浸润(图2)。蜕皮甾酮处理组和吡格列酮处理组表现为肝组织轻、中度脂肪变性,脂滴较模型组明显减少(图3～4)。
       模型组肝组织可见不同程度的汇管区炎症及小叶内炎症;肝小叶内和汇管区出现以单核细胞、淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，临近的脂变肝细胞可见气球样变肝细胞，部分大鼠肝组织小叶内可见坏死灶融合成小片状，并有1例出现碎屑样坏死，1例出现桥接坏死，2例出现脂肪囊肿，2例出现轻度肝纤维化;蜕皮甾酮和吡格列酮治疗组肝脏存在汇管区炎症及小叶内炎症, 未见肝细胞水样变性及坏死, 炎症细胞浸润较轻。据公式P+L+2PN+2BN计算各组的炎症活动度积分，模型组与正常组比较肝脏炎症活动度计数差异显著(P<0.01)，蜕皮甾酮和吡格列酮治疗组大鼠肝组织呈轻、中度肝细胞脂肪变性，无大泡性脂肪变形成，小叶内、汇管区炎症坏死减轻，未见碎屑样坏死和桥接坏死，肝脏炎症活动度计数较模型组明显下降(P<0.01)，但组间差异无统计学意义。结果见表3。表3 各组大鼠肝脏病理学结果分析
       4 讨论
       非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征。NAFLD包括单纯性脂肪肝及由其演变的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)和NASH相关性肝纤维化、肝硬化，是一类与遗传环境代谢应激相关的肝脏疾病谱[4]。NAFLD病因中，脂肪变性常见因素包括营养不良、药物、肥胖症、糖尿病、高脂血症等;尽管这些因素在NAFLD起到重要作用，但NAFLD的发病及进展至NASH的机制尚未完全阐明，目前广泛接受的观点是Day和James提出的“二次打击”学说[5]。第一次打击指各种原因如肥胖、胰岛素抵抗引起的肝脏脂肪沉积和肝脂肪变性。第二次打击主要为氧化应激导致的脂质过氧化损伤及某些异常细胞因子直接损伤肝细胞, 引起肝脏炎症坏死和纤维化。
       超氧化物歧化酶(SOD)是体内十分重要的抗氧化酶，其本质是一种生物活性蛋白质，这种酶具有清除新陈代谢中产生的活性氧中的超氧阴离子自由基的能力，在维护机体活性氧代谢的平衡中起重要作用，是机体抗氧化防御系统的重要成员。丙二醛(MDA)是自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸而引发的脂质过氧化作用的最终分解产物，其含量水平可反映机体内细胞脂质过氧化的程度。本实验结果表明，造模组SOD活性明显低于对照组，同时MDA含量明显高于对照组(P<0.01)，说明氧应激、脂质过氧化与NAFLD的发病存在某种联系。目前有研究认为，在NAFLD的发病过程中肝脏微粒体细胞色素P450(CYP)酶系统受到激活催化，释放大量的活性氧和自由基;脂质过氧化的终产物MDA的半衰期较活性氧(ROS)长，且能弥散到细胞内、外其他靶位，扩大氧应激的损害，而且MDA能与蛋白质结合，形成复合物，从而激活机体的免疫反应而参与肝损害，诱导细胞死亡、炎症和纤维化;氧化应激过程可激活枯否细胞(Kupffer cell)，激活后的Kupffer细胞可产生一系列可溶性细胞因子，可损伤肝内皮细胞，增强中性粒细胞及单核细胞产生活性氧介质的能力，释放氧自由基，致脂质过氧化，进一步加重肝损伤，还可诱导肝细胞线粒体解偶联蛋白(UCP2)基因表达，导致肝细胞坏死增多;另外氧应激还可通过ROS和/或脂质过氧化反应性醛类产物的作用，如MDA和壬烯(HNE)激活肝星状细胞(HSC)，促使其活化、增殖、转型为肌成纤维母细胞分泌细胞外基质导致肝纤维化[6]。
       ECR有多种药理学作用，如促进核糖核酸和蛋白质合成，影响糖脂代谢，抗氧化应激，免疫调节、降血脂、抗氧化、抗纤维化和改善肝功能的作用[2]。Cai YJ[7]等研究表明，蜕皮素有抗氧化和清除自由基的作用，而且口服蜕皮素(0.1 mg·kg-1·d-1)30 d以上可以降低细胞膜的脂质氧化反应。本研究结果显示，与模型组相比蜕皮甾酮组肝组织MDA的含量明显减少，而SOD的含量明显增加，这明蜕皮甾酮在治疗大鼠非酒精性脂肪性肝病时，可能通过增加肝组织SOD的含量和减少MDA的含量来减轻肝组织氧化应激水平，发挥抗氧化与肝脏保护作用。
       本实验采用改良高脂膳食成功复制了大鼠非酒精性脂肪性肝病的模型，大鼠脂肪肝程度随造模时间延长而加重。在高脂膳食的同时，应用蜕皮甾酮灌胃干预脂肪肝，结果用药后肝脏指数及血清中TC及TG水平下降，肝功能、抗氧化能力改善;说明蜕皮甾酮具有预防大鼠血脂增高，减少肝脏对游离脂肪酸的吸收, 清除肝内甘油三酯作用; 有清除机体自由基, 增强抗氧化能力的作用, 可以调节和改善自由基代谢平衡，保护肝细胞; 能降低肝细胞膜的通透性, 减少血中ALT，AST的水平，维持肝功能的正常; 病理检查进一步证实肝组织脂肪变性及炎症活动程度减轻。此外, 我们在实验中也发现，虽然蜕皮甾酮可以改善大鼠非酒精性脂肪性肝病的生化指标及肝组织脂肪变性及炎症活动度, 但未能将这些指标恢复到正常水平，可能与高脂饮食的诱因未祛除和蜕皮甾酮使用的用量、疗程不足或其他因素有关。因此，本实验研究结果为蜕皮甾酮在预防非酒精性脂肪性肝病的临床应用中提供了依据，而其具体的作用机制及用量、疗程有待于在进一步研究中探索。
       【参考文献】
         　　[1] 中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南[J].中华肝脏病杂志，2006,9(3):325.
       
       [2] 邹德平，曹 灵，陈 秋.蜕皮素药理作用研究进展[J].中国新药杂志，2008，17(5):371.
       
       [3] 王 倩，管小琴. 大鼠非酒精性脂肪肝造模方法的改进[J]. 世界华人消化杂志,2007,15(11): 1219.
       
       [4] Ong JP, Younossi ZM. Epidemiology and natural history of NAFLD and NASH.Clin Liver Dis[J].2007，11(1):1.
       
       [5] Day CP,James OF. Steatohepatitis:a tale of two “hits”? [J] .Gastroenterology.1998，114:842.
       
       [6] Mitsuyoshi H,Itoh Y,Okanoue T.Role of oxidative stress in nonalcoholic steatohepatitis [J]. Nippon Rinsho.2006，64(6):1077.
       
       [7] Cai YJ,Dai JQ,Fang JG,et al. Antioxidative and free radical scavenging effects of ecdysteroids from Serratula strangulate [J].Can J Pharmacol, 2001， 80(12):1187.