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       【摘要】 
       目的观察生地以低聚糖为主的提取物RGOS的急性毒性。 方法测定生地RGOS对小鼠灌胃、超声雾化吸入及尾静脉注射3种给药途径的最大给药量或LD50，观察给药后的毒性反应及死亡情况,连续14 d。 结果生地RGOS对小鼠灌胃的最大给药量为49.6 g/kg(119.04 g生药/kg);对小鼠超声雾化吸入的最大给药量为28.8 g/kg(65.38 g生药/kg);对小鼠尾静脉注射的LD50为7.88 g/kg(17.89g生药/kg)，其95%平均可信限L95为(7.88±0.61) g/kg。静脉注射后小鼠体质量增长明显低于对照组，于第7天左右基本恢复。 结论生地RGOS对小鼠灌胃、超声雾化吸入无明显毒性反应;静脉注射有一定的急性毒性，对小鼠体质量增长有一定的抑制作用。
       【关键词】  生地提取物; 急性毒性; 最大给药量; LD50
       Study on the Acute Toxicity of Extract of Radix Rehmanniae with Different Routes of Administration in Mice
       XIA Huili, LIU Li*, XU Desheng, DING Liqin, MAO Xiaping
       (Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200021, China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the acute toxicity of the extract of Radix Rehmanniae containing mainly oligosaccharide.MethodsThe maximum administration dosage and the LD50 of the RGOS were determined intragastrically, ultrasonic atomizing inhalation and intravenous injection in mice. The toxic reaction and the death condition after administrations were observed for consecutive 14 days.ResultsThe maximum administration dosage by intragastrical and ultrasonic atomization inhalation was 49.6 g/kg(119.04 g crude drug /kg) and 28.8 g/kg(65.38 g crude drug /kg) respectively. The LD50 by intravenous injection was 7.88 g/kg 17.89 g crude drug /kg,and its average confidence interval was (7.88±0.61) g/kg. After intravenous administration, the growth of body weight in mice was lower than that of normal control, and it almost recovered 7 days after administration.ConclusionRGOS of Radix Rehmanniae showed no sign of toxicity by intragastrical administration and ultrasonic atomizing inhalation in mice, while it showed some acute toxicity by intravenous injection, and could restrain the growth of body weight in mice.
       Key words：The extraction of Radix Rehmanniae; Acute toxicity; Maximum administration dosage; LD50
       生地为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥块根，功能清热凉血，养阴生津[1]。
       由单味生药制成的生地注射液曾为本院自制制剂，在临床研究中发现对治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)有一定疗效[24]，药理学研究发现对博莱霉素致大鼠特发性肺间质纤维化(IPF)的基质重建有调控作用[5]，对大肠杆菌脂多糖(LPS)致大鼠肺部炎症有一定的作用[6]。但中药注射剂成分复杂，质量较难控制，且使用不便，提取生地中有效成分，并改变给药途径，将使生地用于治疗COPD更为可行。
       本室从生地中提取了不同部位进行活性成分筛选，离体试验显示以低聚糖为主的部分有一定活性[7]。在此基础上，本实验室对生地低聚糖(RGOS)进行急性毒性实验，观察对小鼠灌胃、超声雾化吸入及静脉注射后的中毒反应及死亡情况，初步评价其安全性，为后续试验的剂量设计、给药途径的选择提供参考依据。
       1 材料与仪器
       1.1 药物生地RGOS，为棕黄色粉末，由上海中医药大学附属曙光医院中药制剂研究室提供，临用前以生理盐水配制成所需浓度。批号20080312，用于灌胃给药，每克受试物相当于2.4 g生药;批号20080618，用于静脉注射及超声雾化吸入给药，每克受试物相当于2.27 g生药。
       1.2 动物昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，体质量1822 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。动物购进后在本院动物房饲养观察2 d后用于试验。
       清洁级实验室饲养，温度2230℃，湿度40%80%(通常60%)，噪声≤60分贝，换气次数25次/h，工作照度12h明12h暗。所用饲料为大鼠饲养料，购自上海银根实验动物养殖场。
       1.3 仪器EB-280型电子天平，日本岛津;402A型超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备有限公司。
       2 方法
       2.1 灌胃生地RGOS能配制的最大浓度为1.24 g/ml，经预试小鼠按此浓度、按最大体积40 ml/kg体重的给药量1次灌胃给药后无中毒反应及死亡，确定灌胃法应进行最大给药量试验[8]。
       取20只小鼠，雌雄各半，给药前禁食不禁水12 h，按上述浓度、体积一次灌胃给药。
       2.2 超声雾化吸入生地RGOS在较高浓度时超声不能雾化，经预试确定能超声雾化的最高浓度为0.24 g/ml。将药液置于超声雾化器的溶液杯中，雾化后气雾通过波纹管通入一容量为4 L的玻璃钟罩内，钟罩下置一木板，使两者边缘密闭。取5只小鼠放入钟罩内，按上述浓度1日内对小鼠进行3次喷雾，用量为5只小鼠的总剂量(按每次每只小鼠40 ml/kg计算)，小鼠精神状态、行为、排泄等均正常。根据预试情况，确定按上述剂量对小鼠进行喷雾吸入给药，1日内3次，进行最大给药量试验[8]。
       取40只小鼠，按体重分层随机分组，每组20只，雌雄各半，分成正常对照组、生地RGOS组。给药前禁食不禁水12 h，每次将5只小鼠置于钟罩内，药液雾化后充满钟罩，由小鼠自主吸入，用量为5只小鼠的总剂量(按每次每只小鼠40 ml/kg计算)，雾化结束后，观察钟罩内白色气雾消失后再等2 min，取出小鼠。
       2.3 尾静脉注射经预试可测得生地RGOS对小鼠尾静脉注射的100%及0%估计致死剂量，确定应进行LD50的测定[8]。
       在上述100%及0%估计致死剂量之间按等比关系分为5个剂量组。取60只小鼠按体质量分层随机分为6组，分别为正常对照组和5个不同给药剂量组，每组10只，雌雄各半，分笼饲养。给药前禁食不禁水12 h，小鼠均按25 ml/kg给药容量一次尾静脉注射给药。
       2.4 观察指标
       2.4.1 一般观察小鼠给药当天，尤其是给药后4 h内严密观察。然后每天上、下午各1次，连续观察14 d，包括动物精神状态、饮食、行为、分泌物、排泄物等，并记录中毒死亡时间，中毒反应起始时间、持续时间、恢复期是否可逆。
       2.4.2 体质量和耗食量分别在给药前2天、给药第1天、给药第7天、给药第14天记录体质量和耗食量。
       2.4.3 剖检在观察期(14 d)结束后进行大体解剖，观察心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、胃、肠、食管、气管、睾丸、附睾、卵巢、子宫等各主要脏器，观察是否有出血点、水肿等情况，并作书面记录。
       3 结果
       3.1 灌胃和超声雾化吸入在灌胃给予生地RGOS后，大多数小鼠活动减少，12 h后恢复。喷雾给予生地RGOS时，小鼠在钟罩内毛发略湿，多数小鼠有自主向喷雾口进行呼吸的行为，提示药物气味香甜，较为吸引小鼠，偶见小鼠有跳跃行为，喷雾结束后，小鼠舔毛发行为较为频繁，可能与毛发被气雾沾湿有关。
       给药后第2天起至14天，灌胃和超声雾化吸入的小鼠毛发、精神、活动、摄食、分泌物、排泄物等均正常，体质量正常增长。在整个观察期(14 d)内无一小鼠死亡。观察期结束后，对小鼠进行大体解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等各主要脏器，未发现有出血点、水肿等异常情况。
       3.2 尾静脉注射小鼠在给予生地RGOS后，高剂量组小鼠在注射后立即惊厥、抽搐，大部分立即死亡，解剖后发现心脏仍有跳动，存活小鼠在惊厥、抽搐过后逐步恢复正常，死亡率为0%组小鼠在注射后一般反应均较为正常，无惊厥、抽搐现象。给药后第2天起至14天，给药组存活小鼠精神、活动、分泌物、排泄物等均正常，无小鼠死亡。
       各剂量组小鼠的死亡情况见表1，用综合计算法[9]，计算出生地RGOS的LD50为7.88g/kg，其95%平均可信限L95为(7.88±0.61)g/kg。表1 生地RGOS的LD50
       小鼠体质量的增长情况见表23。给药第2天，生地RGOS雌雄各剂量组存活小鼠体质量不增长甚至减少，与正常对照组相比，有显著或非常显著差异;给药第7天，雌性各组小鼠体质量增长与正常对照组相似，至14天，某些组已略高于正常组;给药第7、14天，各组雄性小鼠体质量增长仍少于正常对照组，但除雄性7.03g/kg组外，其余各组无显著性差异。表明小鼠静脉注射生地RGOS后，其体质量的增长受到明显的抑制，于给药后7天左右基本恢复，雌性小鼠的恢复能力要好于雄性小鼠。表2 静脉注射生地RGOS后对雌性小鼠体质量的影响试验分两批，设2个正常对照组，RGOSⅠ组与正常对照组Ⅰ组为一批，RGOSⅡ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组与正常对照组Ⅱ组为一批，各组与同批正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01表3 静脉注射生地RGOS后对雄性小鼠体质量的影响与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
       生地RGOS雌雄各组小鼠在给药后第1天，平均耗食量明显少于正常对照组，于给药第2天开始恢复。给药14 d后，处死动物，进行大体解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等各主要脏器，未发现有出血点、水肿等异常情况。
       4 结论与讨论
       受试物生地RGOS对小鼠灌胃的最大给药量为49.6 g/kg(相当于119.04 g生药/kg);对小鼠超声雾化吸入的最大给药量为28.8 g/kg(相当于65.38 g生药/kg);对小鼠尾静脉注射的LD50为7.88 g/kg(相当于17.89 g生药/kg)，其95%平均可信限L95为(7.88±0.61) g/kg。
       生地成人临床常用口服剂量为915g[1]， RGOS对小鼠灌胃的最大给药量按生药量计算为其476倍(成人体重按60kg计算)，一般认为，1日最大给药量相当于成人临床日用量的100倍以上，是较为安全的[10]。
       生地注射液(2g生药/10ml)临床治疗COPD用量为每次6080 ml，每日静脉滴注1次，连续14 d[24];对大鼠的有效剂量为生地10g/kg每日腹腔注射，连续7或30 d[5]、生地注射液760mg/kg(以固形物量计)静脉注射[6]。生地RGOS的成分较为单纯，其LD50与上述注射剂量对比，还是有一定的安全阈的。雌雄小鼠静脉注射生地RGOS后，其体质量增长及食耗量受到明显的抑制，表明静注RGOS对小鼠的食欲有一定的抑制作用，并影响小鼠的体质量增长。可见，静脉注射在一定的剂量范围内，是较为安全的，但对有效剂量的要求较高，对体质量有一定影响，而超声雾化吸入在最大给药量时亦无明显毒性反应，且给药方便，对于治疗COPD无疑是一个理想的给药途径。
       【参考文献】
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