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       【摘要】 
       目的探讨复方脑得生有效成分与脂质体模拟生物膜的相互作用，以了解其有效成分体内吸收的情况。方法采用平衡透析与高效液相色谱联用技术，对复方脑得生有效成分与脂质体模拟生物膜相互作用进行分析;同时考察了透析时间、模拟生物膜浓度和缓冲溶液pH值对复方脑得生有效成分与模拟生物膜相互作用的影响。结果复方脑得生有效成分与模拟生物膜吸收检测结果表明，有11个指纹峰吸收明显;模拟生物膜的浓度对复方脑得生有效成分与模拟生物膜相互作用影响较大，随浓度增加，色谱峰面积明显减小，符合被动吸收规律;pH值对其中3个成分的吸收有影响。结论采用脂质体平衡透析和高效液相色谱联用的方法，能方便、有效地预测复方脑得生有效成分在体内的吸收情况，揭示该复方的潜在活性成分，为其药效物质基础深入研究提供依据。
       【关键词】  复方脑得生; 脂质体模拟生物膜; 脂质体平衡透析; 高效液相色谱
       Study on the Interaction between the Effective Components of Fufang Naodesheng Prescription and Liposome Biomembrane
       HE Lishan, XU Bin, WANG Guangzhong, LIU Yanwen*
       (Provincial and the Ministry of Education Key Laboratory of Resource Science and Chinese Herbal Compound in Chinese Medicine,Hubei College of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061, China)
       Abstract：ObjectiveTo explore the interaction between the effective components of Fufang Naodesheng Prescription and liposome biomembrane, in order to know the effective components of the body absorption.MethodsThe effective components of Fufang Naodesheng Prescription, interacted with liposome, were analyzed and identified by the balanced dialysis and HPLC coupling technique. The experiment conditions were investigated, including the balance time, the liposome concentration, and the pH value of buffer. ResultsThe test results of interaction between the effective component of Fufang Naodesheng and liposome biomembrane indicated that there had eleven fingerprint absorption peaks. The concentration of liposome and the pH value of buffer remarkably affected the absorption of most constituents.ConclusionThe developed method can simply and effectively estimate the absorption of the effective components in Fufang Naodesheng,reveal the potential effective ingredients of this compounds, and provide the basis for further research of its material foundation.
       Key words： Fufang Naodesheng Prescription; Liposome biomembrane; Liposome equilibrium dialysis; HPLC
       脑得生片和脑得生丸为传统中药制剂，由三七、川芎、红花、葛根、山楂5味中药组成，收载于19952005年Ⅲ版《中国药典》，具有活血化瘀，通经活络的功效。本实验室近年来对复方脑得生传统制剂的药效物质基础进行了研究，确定了方中各中药的有效部位，并将有效部位组方研制成脑得生软胶囊新制剂。
       目前，传统的中药及复方药效物质基础研究尚停留在分步提取分离、确定有效部位和有效成分的体外水平，不能反映药效物质体内吸收的情况。而药物的生物膜通透性是药物被吸收并进入靶点发挥药理活性的前提，因此研究中药复杂体系中各类成分的生物膜通透性有助于揭示其药效物质基础。脂质体是一种理想的模拟生物膜，国内外的研究均表明，药物与脂质体的结合和其被小肠吸收具有很好的相关性[1，2]。本论文主要研究复方脑得生有效成分与脂质体模拟生物膜的相互作用，筛选出能与模拟生物膜结合的成分，以期为进一步阐释复方脑得生的药效物质提供科学依据。
       1 仪器与试药
       1.1 仪器Agilent 1100 series 高效液相色谱仪(G1322A排气阀，G1311A泵，G1316A柱温箱，G1314A紫外检测器)，Agilent色谱工作站;十万分之一天平(Sartorius BP211D);万分之一天平(Metter Toledo AL204)。
       1.2 试剂透析袋(分子量12 000，上海绿鸟科技发展有限公司);蛋黄卵磷脂(国药集团化学试剂有限公司);三七皂苷(昌宁德康科技有限公司，20060707);川芎挥发油(本实验室自制);山楂、红花、葛根提取物(本实验室自制);三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、葛根素、大豆苷元、羟基红花黄色素A、牡荆素(均购自中国药品生物制品检定所);缓冲液：10 mmol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4缓冲系统(pH 5.4，7.0和7.4)，乙腈(Fisher公司，色谱纯)，甲醇(分析纯，上海振兴化工一厂)，水为自制双蒸水，其余试剂均为分析纯。所有的样品和试剂均经0.45 μm的微孔滤膜过滤。
       2 方法与结果
       2.1 色谱分析条件色谱柱为Hypersil ODS-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为0.2%(V/V)磷酸水溶液-甲醇-乙睛，梯度洗脱: 020 min，3% →8% (甲醇)，4%→6%(乙腈);2045 min， 8%→8% (甲醇)，6%→7%(乙腈);4560 min，8%→13% (甲醇)，7%→8%(乙腈);60100 min，13%→12% (甲醇)，8%→24%(乙腈);流速1 ml·min-1;检测波长210nm。
       2.2 样品的制备参照2005版《中国药典》所收录脑得生片的处方用量：三七78 g，川芎78 g，红花91 g，葛根261 g，山楂(去核)157 g。根据方中各药有效部位的收得率，称取各中药有效部位分别为：三七皂苷5.46 g，川芎挥发油4.20 g，红花总黄酮9.28 g，葛根总黄酮21.92 g，山楂总黄酮4.87 g。将上述各中药有效部位组方，用20%乙醇溶解，配制成相当生药浓度为1 g·ml-1的药液，备用。
       2.3 模拟生物膜的制备称取蛋黄卵磷脂0.30 g置10 ml容量瓶中，用乙醚溶解;将10 ml pH 7.0的磷酸盐缓冲液加入带磁力搅拌的烧杯中，置入浴温为(60±1)℃的水浴，磁力搅拌。用注射器将溶有卵磷脂的乙醚液缓慢滴入烧杯中，搅拌至无乙醚味，用缓冲液定容到10 ml，即得浓度为30 g·L-1的脂质体溶液 (pH 7.0磷酸缓冲液制得)。其它浓度和pH值的脂质体溶液制法相同[3]。
       2.4 复方脑得生有效成分与脂质体模拟生物膜的相互作用
       2.4.1 平衡透析方法用透析夹将长约12 cm分子截止量为12 000的透析袋一端密封，其中加入1 ml药液和2 ml脂质体溶液(30 g·L-1，pH 7.0)，将透析袋放入装有缓冲液(pH 7.0)的烧杯中;另取 1个透析袋加入1 ml药液和2 ml缓冲液(pH 7.0)做平行空白对照，其余操作相同。然后放置于4℃环境中透析24 h，使袋内外药物浓度达到平衡。改用浓度为60 g·L-1，90 g·L-1的脂质体溶液及pH 值为5.4 和7.4的缓冲液同法操作，得到不同浓度和不同pH条件下的透析液样品;取透析液，挥干，用甲醇定溶至25 ml，备用。
       2.4.2 平衡透析时间的考察分别考察了透析时间为4，8，12，16，20和24 h的透析情况，检测结果表明透析袋外液浓度(以大豆苷元作为检测指标)在20 h已达最大值，在2024 h之间透析袋外液浓度不再变化，说明药物的吸收和透析达到平衡，最后选择透析时间为24 h[4]。
       2.4.3 复方脑得生有效成分与脂质体模拟生物膜相互作用的研究复方脑得生有效成分与模拟生物膜相互作用后的透析液，和复方脑得生有效成分的直接透析液的HPLC图，如图1所示。复方脑得生有效成分在HPLC上有22个色谱峰，与直接透析液比较，复方脑得生有效成分与生物膜结合后的透析液中有11个色谱峰的峰面积明显减少，分别为峰4，5，8，9，10，14，15，16，17，21，22。这11个峰即是复方脑得生有效成分中能与模拟生物膜相互作用的成分，是复方脑得生中的潜在活性成分，它们部分与模拟生物膜结合后不能透过透析袋，因而峰面积减小[5，6]。
       图1 复方脑得生有效成分直接透析液(a)和与模拟生物膜作用后透析液(b)的色谱图
       2.4.4 复方脑得生有效成分指纹色谱峰的识别在复方脑得生有效成分与模拟生物膜相互作用后的HPLC指纹图谱中，通过标准品对照的方法，可以识别7个有效成分的色谱峰(如图2所示)。在图2中的峰4为葛根素，峰5为羟基红花黄色素A，峰10为牡荆素，峰17为大豆苷元，峰18为三七皂苷R1， 峰20为人参皂苷Rg1，峰21为人参皂苷Re。综合图1和图2可知，葛根素、羟基红花黄色素A、牡荆素、大豆苷元、人参皂苷Re与模拟生物膜有一定的相互作用，而三七皂苷R1、人参皂苷Rg1在此实验条件下与模拟生物膜作用不大明显。
       2.4.5 不同的模拟生物膜浓度对复方脑得生有效成分吸收的影响　分别考察了复方脑得生有效成分与浓度为30，60和90 g·L-1 (均用pH 7.0磷酸盐缓冲系统制得)的模拟生物膜的作用，比较三者色谱图的差别(如图3所示)。图1中峰面积有变化的11个色谱峰随模拟生物膜浓度增加，色谱峰面积也明显减小，在色谱图上表现为a>b>c>d，表明随着脂质体浓度的增大，复方脑得生有效成分与模拟生物膜的相互作用也增强;而图1中峰面积没有变化的色谱峰，在不同浓度的模拟生物膜中依然表现出稳定性。
       a.复方脑得生与模拟生物膜作用后的透析液 b.三七皂苷R1 c.人参皂苷Rg1 d.人参皂苷Re e.大豆苷元 f.羟基红花黄色素A g.葛根素 h.牡荆素
       图2 复方脑得生有效成分与模拟生物膜作用后的透析液和标准品对照的色谱图
       图3 复方脑得生有效成分与不同浓度的模拟生物膜透析色谱图
       2.4.6 不同的pH值对复方脑得生有效成分吸收的影响人体内的环境是一个pH相对稳定的缓冲体系，血液及组织液的正常pH约为7.4，细胞内液pH约为7.0，人体主要吸收器官小肠肠道内的pH约为5.4。本实验在pH为5.4，7.0和7.4的磷酸盐缓冲体系条件下，分别测定复方脑得生有效成分与模拟生物膜(60 g·L-1)的相互作用，比较三者的差别(如图4所示)。结果表明，峰1，3在pH为7.4时的吸收很明显，峰2在pH为5.4和7.0时的吸收明显;而复方脑得生其它有效成分与模拟生物膜的作用则不随pH值的变化而变化。
       图4 复方脑得生有效成分与不同pH的模拟生物膜作用后的色谱图
       3 讨论
       本实验采用了平衡透析与高效液相色谱联用技术研究中药复方脑得生有效成分与模拟生物膜相互作用的新方法，将活性检测、成分分析与成分识别相结合，适合中药复杂体系的药效物质基础研究。
       采用0.2%(V/V)磷酸水溶液-甲醇-乙腈梯度洗脱，使复方脑得生主要有效成分得到了较好的分离，展示了较完整的HPLC色谱图。
       中药提取物复杂成分不经分离直接与模拟生物膜结合，符合中药多成分、多靶点协同作用的特点;由于模拟生物膜可以通过改变相关的影响因子很方便地模拟人体的生理环境，且具有较好的稳定性，从而为研究药物在体内的吸收以及活性成分的筛选和研究提供了一种简便的模型。
       【参考文献】
         　[1] Beigl F, Yang Q, Lundahl P. Immobilized-liposome chromatographic analysis of drug partitioning into lipid bilayers[J]. J Chromatogr A, 1995, 704: 315.
       
       [2] 盛亮洪,李睿岩,李 萍.固定化脂质体色谱研究中药方剂的细胞膜通透性成分及其质量控制[J].分析化学, 2004, 32(12)：1595.
       
       [3] 平其能.现代药剂学，第1版[M].北京:中国医药科技出版社,1998：665.
       
       [4] 董倩倩,李睿岩,李 萍.丹参与脂质体模拟生物膜相互作用研究[J].中国药学杂志，2007，42(16): 1208.
       
       [5] 周 鹏,李 萍,韦英杰.复方丹参方与脂质体模拟生物膜的相互作用[J].中国天然药物，2008，6(4): 278.
       
       [6] Qi LW, Li P, Li SL, et al. Screening and identification of permeable components in a combined prescription of Danggui Buxue decoction using a liposome equilibrium dialysis system followed by HPLC and LC-MS[J].J Sep Sci,2006,29: 2211.