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       【摘要】 
       目的建立HPLC法测定青环海蛇中有效物质1-甲基海因的含量。方法Dikma inertsil SIL-100A(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为正己烷-乙醇(82∶18，V/V)，检测波长为218 nm，流速为1.0 ml·min-1，柱温为25℃。结果1-甲基海因质量在0.448～1.568 μg之间线性良好，r=0.999 5;平均加样回收率为99.34%，RSD为2.12%。结论该测定方法简便快捷、准确性好、精密度高，可用于青环海蛇中有效物质1-甲基海因的含量测定，为海蛇质量标准的建立提供依据。
       【关键词】  高效液相色谱; 青环海蛇; 1-甲基海因
       海蛇为眼镜蛇科海蛇亚科的一类毒蛇，目前世界上发现的海蛇约有90种。其药用始载于唐代陈藏器的《本草拾遗》，“主赤白毒痢，五野鸡病，恶疮。炙食，亦烧末服一、二钱匕”。作为祛风燥湿、通络活血、攻毒和滋补强壮等功效良药，常被用于治疗风湿痹痛、四肢麻木、关节酸痛、疥癣恶疮等症[1]。东南亚海域游移的海蛇有9属15种，主要集中于中国南海海域，青环海蛇为该海域优势蛇种。目前对海蛇的化学成分含量测定的报道较少，前期我们在药效实验的指导下，从青环海蛇中分离得到1-甲基海因。现代研究表明1-甲基海因含有活性酰脲基团，具有广泛的生理活性[2]。本文采用高效液相色谱法测定了3批青环海蛇中1-甲基海因的含量，以期为海蛇的质量控制提供可靠的依据。
       1 材料与仪器
       1.1 药品1-甲基海因(自制，纯度大于90%，采用面积归一化法测定);甲醇、乙腈、异丙醇(色谱纯)，正己烷、乙醇、醋酸乙酯(分析纯，经过重蒸处理)。3个批次青环海蛇药材。
       1.2 仪器岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪(SPD-10A 紫外检测器，N2010数据工作站);BP211S型(Max220 g，d=0.1 mg)Sartorius电子分析天平;BUG25-12型超声波发生器(上海)。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件色谱柱为Dikma inertsil SIL-100A(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为正己烷-乙醇(82∶18);流速为1.0 ml·min-1;检测波长为218 nm;柱温为25℃。供对照用1-甲基海因、样品色谱图见图1～2。
       图1 1-甲基海因色谱图
       图2 青环海蛇供试品色谱图
       2.2 检测波长的选择通过UV扫描，1-甲基海因在218.32 nm波长处有最大吸收，故选择218 nm为测定波长。结果见图3。
       图3 1-甲基海因扫描图
       2.3 1-甲基海因溶液的制备取1-甲基海因10mg，精密称定，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成0.112mg·ml-1的溶液，即得。
       2.4 供试品溶液的制备取青环海蛇粗粉1g，精密称定，置100ml圆底烧瓶中，精密加入甲醇40ml，回流提取90 min，滤过并浓缩至10ml，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
       2.5 线性关系的考察分别精密吸取1-甲基海因溶液4，6，8，10，12，14 μl 注入高效液相色谱仪，测定各自峰面积。
       以质量为纵坐标，峰面积值为横坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y=435 436X-20 982，相关系数r=0.999 5。结果见表1及图4。表1 1-甲基海因线性关系考察结果
       结果表明，1-甲基海因在0.448～1.568μg 范围内与峰面积值呈良好的线性关系。
       2.6 稳定性实验将制备好的供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h进样，10 μl /次，记录峰面积，结果在8h内峰面积无明显变化，RSD=2.33%。供试品溶液在8 h内稳定。结果见表2和图5。
       2.7 精密度实验精密吸取样品供试液10μl，在上述色谱条件下重复进样5次，测定峰面积，计算相对标准偏差 RSD=1.28%，仪器精密度符合要求。结果见表3和图6。表2 供试品溶液稳定性实验结果表3 精密度实验结果
       2.8 重复性实验按拟定的含量测定方法，取同一批药材粗粉制备5份供试品溶液，分别进行测定，测得峰面积值并计算1-甲基海因的含量。结果平均含量为1.090mg·g-1，RSD=1.94%，表明重复性良好。结果见表4。表4 样品重复性实验
       2.9 加样回收率实验精密称取青环海蛇药材粗粉各9份，分别加入1-甲基海因溶液适量，按“2.4”项下供试品溶液制备方法，制备加样回收供试品溶液，并测定每份的含量，计算回收率。结果见表5表5 加样回收率实验
       2.10 样品含量测定分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，进样，记录峰面积，按外标法计算青环海蛇中1-甲基海因的含量。结果见表6。表6 青环海蛇药材中1-甲基海因的含量测定结果
       3 讨论
       目前对海因类药物含量测定的研究较缺乏。主要有非水滴定法和分光光度法，而这两种方法的误差相对较大，不够准确[3]。选用DIKMA C18 (150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇-水、乙腈-水、异丙醇-水、乙腈-水-磷酸等为流动相，均不能达到分离要求，且多种比例条件下，相对保留时间太短(tR﹤3min)，药材中1-甲基海因不能与其他成分分离。选用DIKMA inertsil SIL-100A(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，以醋酸乙酯-甲醇、异丙醇-乙醇、正己烷-乙醇等为流动相进行条件探索，其中正己烷-乙醇(82∶18)，流速1.0ml/min，柱温25℃，检测波长218nm，分离效果良好，满足青环海蛇中1-甲基海因测定要求。
       利用HPLC对青环海蛇中有效物质1-甲基海进行含量测定，3批样品1-甲基海因的平均含量为0.119%。该测定方法具有操作简便、精密度高、准确性好等优点，可为海蛇的质量标准制定提供依据。
       【参考文献】
         　[1] 张黎明，陈志龙.海蛇的药用价值[J].中医药学报，2002，30(5)：25.
       
       [2] 白雪媛，杨亚楠，王永生.海因类化合物的药理作用进展[J].中成药，2006，28(10)：1512.
       
       [3] 崔 群，吴 月.海因及其衍生物的定量分析[J].南京化工大学学报，1998，20(3)：100.