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       【摘要】 
       目的观察强精煎对实验小鼠睾丸Fas和Fasl蛋白表达的影响，探讨其抑制生精细胞凋亡的机制。方法将80只健康雄性昆明种小鼠分为正常组、模型组，强精煎组、黄精赞育胶囊组，除正常组用生理盐水外其他各组均以环磷酰胺注射液40 mg/kg腹腔注射造模，造模成功后，正常组及模型组分别给予蒸馏水，后两组分别给予相应药物灌胃治疗30 d。第31天处死小鼠，利用H-E染色观察小鼠睾丸病理形态，用免疫组织化学SABC法检测Fas和Fasl蛋白在小鼠睾丸实质组织中的表达。结果与模型组比较，强精煎组和黄精赞育胶囊组睾丸Johnson 评分偏高，Fas和Fasl蛋白的表达率偏低(P<0.01);与空白组比较，模型组Johnson 评分偏低，Fas和Fasl蛋白表达率偏高(P<0.01);强精煎组和黄精赞育胶囊组差异无统计学意义(P>0.05)。结论强精煎可以下调Fas和Fasl蛋白在受损伤小鼠睾丸实质组织中的表达，这可能是其抑制生精细胞凋亡的分子机制之一。
       【关键词】  强精煎; 生精功能障碍; 实验研究
       大量研究表明，生精细胞的过度凋亡是导致生精功能障碍的重要病因，而Fas/Fasl系统在生殖细胞的凋亡中又起着重要作用[1]。我们前期的研究显示，以补肾健脾为主要功效的中药强精煎具有抑制环磷酰胺所致小鼠睾丸生精细胞过度凋亡的作用[2]，而该作用机制是否也与Fas/Fasl系统有关尚不清楚，为此笔者进行了初步探索。
       1 材料
       1.1 药物强精煎(经验方，主要由菟丝子、枸杞子、益母草、当归、党参、牡蛎组成)，为提高本实验的可重复性，采用单味中药配方颗粒，由江苏省江阴天江药业有限公司生产，批号：0803193，将各单味药物倒入量杯，加入100℃蒸馏水，充分混匀，配成药物浓度为0.335 g/ml的混悬液，密封，置4℃冰箱保存备用。黄精赞育胶囊(由何首乌、黄精、菟丝子、枸杞子、五味子、熟地黄等组成)，上海新亚药业邗江有限公司生产， 批号：080101 。去除胶囊外壳，将胶囊内药物颗粒研磨成粉状，80目过筛后，加入蒸馏水继续研末5 min，配成药物浓度为0.037 5 g/ml的混悬液，密封，置4℃保存备用。
       1.2 试剂注射用环磷酰胺(CP)，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，生产批号：08012921。以0.9%氯化钠注射液配制成4 mg/ml的溶液，现配现用;Bouin液：将冰醋酸、甲醛、苦味酸饱和水溶液按1∶5∶15比例配制，现配现用;即用型Fas、Fasl多克隆抗体及SABC免疫组化染色试剂盒(标记长臂的生物素羊抗兔IgG、亲和素、过氧化物酶)，底物DAB显色试剂盒，PBS 缓冲液，均购自武汉博士德生物工程有限公司。
       1.3 动物8～9周龄健康雄性昆明种小鼠80只，清洁级，体重(33±2.58)g，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK桂2003-0003，购回后饲养在广西中医学院动物实验中心，检疫1周，根据体质量采用随机数字表法随机分为4组，即正常组、模型组、黄精赞育胶囊组和强精煎，每组20只。
       2 方法
       2.1 造模及给药方法采用环磷酰胺致小鼠生精功能障碍模型，方法参考陈守真法[3]，除正常组给予等剂量生理盐水外，其余各组以环磷酰胺每天按40 mg/kg体重进行腹腔注射，1次/d，连续5 d。造模结束后第1天即给予药物治疗。对照组及治疗组分别灌胃黄精赞育胶囊混悬液或强精煎混悬液0.4 ml/d(按体质量30 g的小鼠体表面积折算均相当于体质量60 kg的成人用量)，正常组和模型组均以等量蒸馏水代替，1次/d，连续30 d。第31天用颈椎脱臼法处死小鼠，取左侧睾丸，放在Bouin液中固定，24 h内取出，用自动脱水机脱水后，用包埋机包埋成蜡块备用。
       2.2 睾丸组织病理形态的观察将已经用石蜡包埋的睾丸标本切成厚约4 μm的连续石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察其病理形态，采用Johnson 评分法[4]评价精子发生和精子发生障碍的程度。生精功能正常为10分;各期生精细胞存在，但排列紊乱为9分;生精小管中有少量精子(5～10个) 为8分;无精子，但有许多精子细胞为7分;无精子，仅有少量精子细胞(5～10个)为6分;无精子，但有许多精母细胞为5分;无精子细胞，仅有个别精母细胞(<5个)为4分;仅有精原细胞为3分;无生精细胞，仅有支持细胞的为2分;管腔内无细胞为1分。评分越高精子发生越好，反之，精子发生障碍程度越严重。
       2.3 睾丸组织Fas及Fasl蛋白表达情况的检测严格按照博士德公司所提供的免疫组化SABC法操作步骤分别检测Fas和Fasl，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知的阳性组织作为阳性对照。镜检睾丸组织细胞膜或细胞质内出现棕黄色或棕色染色为阳性细胞。在高倍镜下(400×) 随机检测5个视野，计算500～1 000个细胞中阳性细胞所占的百分比。
       2.4 统计学处理方法参数统计用方差分析，q检验;非参数统计用秩和检验。全部实验数据用PEMS3.1统计软件处理，作相关统计分析。
       3 结果
       3.1 病理形态观察结果因操作不当，于造模开始至第1周先后有8只小鼠死亡。各组的Johnson评分比较见表1。因正常组数据不符合正态性分布，故采用成组设计多组秩和两两比较的q检验法检验。
       3.2 Fas 和Fasl蛋白表达率的检测结果见表2。Fas各组采用秩和检验;Fasl各组采用方差分析，组间比较F=10.026。表1 4组小鼠睾丸病理形态的Johnson评分比较表2 各组小鼠睾丸 Fas蛋白表达率的比较与正常组比较，◇P<0.05，◇◇P<0.01;与模型组比较，◆P<0.05，◆◆P<0.01;与黄精赞育胶囊组比较，*P<0.05，**P<0.01;n=18
       各组的间质细胞、支持细胞、各级生精细胞及精子均可见Fas和Fasl蛋白的阳性表达。Fas多表达在精母细胞、精子及其周围残留胞浆中，Fasl多表达在间质区。
       3.3 病理损伤程度与Fas及Fasl蛋白表达率的关系见表3。表3 72例小鼠睾丸病理损伤程度、Fas和Fasl蛋白表达率间的Pearson相关系数
       4 讨论
       生精细胞过度凋亡是造成睾丸生精功能障碍的直接原因。以往的研究表明，以补肾健脾为主要功效的经验方强精煎具有修复睾丸病理损伤，降低睾丸生精细胞凋亡率的作用，临床治疗少弱精子症可以有效改善精子质量 [2,5,6]。本次研究也显示，腹腔注射环磷酰胺后，模型组小鼠睾丸Johnson评分较正常组明显偏低，而给予强精煎灌胃的治疗组Johnson评分则较模型组有明显改善，与之前的研究相符。
       生精细胞凋亡有多种调节机制，其中胱门蛋白酶在生精小管凋亡调控中具有核心作用，其中涉及死亡受体Fas及其配体 Fasl的信号通路是哺乳动物生精细胞凋亡通过胱门蛋白酶的主要途径之一。该通路又称为外源性通路，Fas为一个单跨膜受体蛋白，属于肿瘤坏死因子受体/神经生长因子受体家族，当其与之配体Fasl结合后可导致 Fas 三聚化，后者通过死亡结构域(DD)与Fas-相关死亡结构域(FADD)结合。FADD的N-末端还包括死亡效应结构域( DED )。Fas/ FADD复合物随后通过 FADD 上的 DED 与胱门蛋白酶原8或 10 结合，并激活后者，从而启动分解信号并导致细胞解体[7]。国内研究证实[8]，Fas及Fasl系统确实可以介导生精细胞的过度凋亡，引起生精功能障碍，并且其定位不只局限在生精小管内，亦可能发生在间质细胞中。本次实验也观察到，模型组各级生精细胞和支持细胞及间质细胞都可见Fas和Fasl的高表达，且Fasl多表达在间质区，Fas多表达在生精细胞。同时，统计显示，所有小鼠睾丸Johnson评分总体与Fas和Fasl的表达率间分别呈负相关性，说明Fas和Fasl系统可能在环磷酰胺所致的小鼠生精细胞过度凋亡中发挥着重要作用，而且靶点较为广泛。组间比较显示，强精煎组Johnson评分和Fas及Fasl表达率与正常组和黄精赞育胶囊组无明显区别，但与模型组区别显著，说明强精煎同黄精赞育胶囊一样，可以下调Fas和Fasl在丸组织中的表达，这可能是其降低生精细胞凋亡率，修复组织损伤，改善受损的生精功能的分子机制之一。
       本次实验在观察中还注意到，强精煎组小鼠睾丸的三类细胞中Fas和Fasl表达率均较模型组有所减少，说明其对三类细胞均有影响。我们知道，间质细胞可以接受黄体生成素的刺激信号分泌睾酮，而睾酮通过调节支持细胞，又对生精细胞的生存和分化具有重要调控作用，同时Francavilla等[9]的研究又表明，人类睾丸 Fas和Fasl的表达是在促性腺激素控制下进行的。所以这可能意味着，强精煎抑制生精细胞凋亡的机制中除了Fas和Fasl系统的直接作用外可能还有内分泌因素的存在，这有待于今后作进一步探讨。
       【参考文献】
         　[1] Lee J, Richburg JH, Younkin SC, et al. The Fas system is a key regulator of germ cell apoptosis in the testis[J].Endocrinology, 1997,138(5):208.
       
       [2] 宾 彬,姚重华,王 杰,等.强精煎对模型小鼠睾丸生精细胞凋亡影响的实验研究[J].中药药理与临床,2008,24(2):91.
       
       [3] 陈守真,靳 镭.冬虫夏草对抗环磷酰胺致小鼠生精障碍的作用[J].中国优生与遗传杂志,2007,15(11):93.
       
       [4] Johnson S G. Testicular biopsy score count-a method for registration of spermatogenesis in human testes: normal values and results in 335 hyponadal males[J].Hormones, 1970,1:2.
       
       [5] 宾 彬,姚重华.强精煎治疗少弱精子症 62例疗效观察[J].辽宁中医杂志,2007,34(11):1586.
       
       [6] 姚重华,宾 彬,赵 霞,等.强精煎对模型小鼠睾丸病理损伤的影响[J].时珍国医国药,2007,18(6):1369.
       
       [7] 贾 悦,王雪松,孙 敏,等.生精细胞凋亡的分子机制研究[J].生殖医学杂志,2007,16(3):213.
       
       [8] 彭弋峰,徐东亮,仲 皖,等.Fas和 FasL 系统在非梗阻性无精子症睾丸中的表达[J].临床泌尿外科杂志,2004,19(2):97.
       
       [9] Francavilla S, Abrizio P, Rucci N, et al. Fas and Fas ligand expression in fetal and adult human testis with normal or deranged spermatogenesis[J].J Clin Endocrinol Metab,2000, 85 :26.